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質粒轉染

質粒轉染技術原理:

轉染類型：根據不同的實驗目的，外源DNA導入哺乳動物細胞又可分為瞬時轉染和穩定轉染。瞬時轉染一般是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到染色體，在外源DNA導入細胞1—4天后收獲轉染細胞對轉染基因的轉錄和復制進行分析。而穩定轉染則需要使外源基因整合于細胞染色體從而得到穩定的轉染細胞株。實現細胞的穩定轉染，通常需要一個抗生素篩選的過程。除DEAE葡聚糖只能用于瞬時轉染，其他方法均可用于瞬時轉染和穩定轉染。

因為不同的細胞在生理代謝及分裂上均存在差異，因此研究者將外源遺傳物質導入細胞的過程中需要選擇不同的方式。目前，將外源物質導入細胞的方法主要分為三大類：1、脂質體（或是脂質體替代物）轉染；2、電轉；3、病毒感染。這三種方法互有優劣。脂質體或是脂質體替代物轉染操作簡便，價格低廉，但是對細胞毒性大。而且，有些細胞通過脂質體轉染效率很低；電轉操作方便快捷，但是需要專門的儀器，對細胞損傷也比較大；病毒感染克服了前兩者的劣勢，感染效率高，對細胞毒性小，但是病毒前期包裝需要大量的時間和精力 。

實驗步驟：

1. 轉染試劑的準備

① 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

② 震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。

2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體[1] 體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

4. 吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

5. 加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

6. 到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入培養基繼續培養24－48小時。

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