磷酸化蛋白—Phos-tg™ 丙烯酰胺
Phos-tag™ SDS-PAGE操作簡單，只需在常規SDS-PAGE膠中加入Phos-tag™ Acrylamide 和二價錳離子或者鋅離子即可進行實驗。在電泳過程中，磷酸化蛋白的磷酸基團與Phos-tag™中的二價金屬離子相結合，降低其遷移速度，從而可區分磷酸化與非磷酸化蛋白。

SDS-PAGE分離不同磷酸化水平的蛋白！

 

　　在不使用放射性同位素的情況下，利用Phos-tag™ SDS-PAGE即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于蛋白質印跡和質譜分析等后續實驗。

　　Phos-tag™ SDS-PAGE操作簡單，只需在常規SDS-PAGE膠中加入Phos-tag™ Acrylamide 和二價錳離子或者鋅離子即可進行實驗。在電泳過程中，磷酸化蛋白的磷酸基團與Phos-tag™中的二價金屬離子相結合，降低其遷移速度，從而可區分磷酸化與非磷酸化蛋白。

 

◆原理

 

◆優點、特色

● 采用Phos-tag™ SDS-PAGE可輕松分離磷酸化蛋白

　  無任何放射性元素及化學標記！

● 可檢測不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

　  無需任何磷酸化抗體！

●  適用于內源性蛋白的磷酸化分析！

 

◆案例、應用

 

 

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】

我推薦使用Phos-tag ™ ——東京大學研究院醫學研究科 小川覺之

 

　　Phos-tag ™ 是專為研究磷酸化蛋白而新開發出來的試劑。此產品使用方便，不但可用于體外實驗，還能定量分析體內蛋白的磷酸化水平。可用于常規電泳實驗，無需購買特殊設備，性價比高。傳統蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑，操作復雜，花費大，且放射性元素會有安全隱患，而Phos-tag ™ 的出現恰恰可以彌補這些缺點，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。

 

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分離效果圖

 

　　Lane 1 為非磷酸化蛋白，Lane 2-5 為磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化狀態不同而條帶遷移率也有所不同。

　　磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據條帶遷移和條帶濃度求得。

 

【資料提供】

日本東京大學研究生院醫學系研究科

 

【二維電泳中的應用：分析hnRNP K 磷酸化異構體】

　　小鼠巨噬細胞J774.1 經LPS 刺激后，裂解細胞，經過免疫沉淀法分離得到hnRNP K。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離hnRNP K 的異構體。利用質譜儀，可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。

 

二維電泳

 

　　同一個等電點的位置上，不同位點發生磷酸化都可以被區分開來（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

 

【結果提供】

　　橫濱市立大學 生命納米系統科學研究科 生物體超分子系統科學專業 木村彌生、平野久理化學研究所RCAI 小原收

 

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】

　　常規SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實驗分析EGF 刺激的A431 細胞中MAPK 磷酸化水平。

 

 

 SDS-PAGE分離不同磷酸化水平的蛋白

1.  Phos-tag^® Acrylamide的溶解

5 mmmol/ Phos-tag^® 液體 (3v/v% 甲醇）：

1)10 毫克  Phos-tag^® Acrylamide 里加入 0.1 毫升 甲醇

2)使用槍頭攪拌混合直至*溶解。

3) 加3.2 毫升 蒸餾水， 用槍頭混勻。

      2-8℃避光保存。不適合零度以下保存。建議保存時間6個月。

      注意：避免溶解過程出現白色懸浮顆粒。

 

2.     α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221），陽性對照（含有磷酸化和非磷酸化α-Casein），如何使用？

　　用水或者上樣buffer溶解。用水溶解后，冷凍保存。電泳條件：Phos-tag^® 50 umol/L,分離膠濃度 10%。

　　電流：30 mM，1小時。

 

3.     用Alkaline Phosphatase(for Biochemistry)（018-10693）進行磷酸化蛋白的去磷酸化反應體系。

　　 37℃，過夜。# 10 mg/mL phosphorylated protein 50 微升
　　 # 0.50 M Tris/HCl buffer (pH 9.0) containing 0.10 M MgCl2 10 微升
　　 # Sterilized water 39 微升
　　 # Alkaline phosphatase（018-10693）. 0.3 unit / 1 μL有一點需要注意:ALP活性化使用Mg離子，相同的非磷酸化蛋白質用ALP處理的樣品的條帶和沒有用ALP處理的樣品的條帶的位置不同。

 

4.     Phos-tag^® SDS-PAGE實驗沒有成功分離磷酸化蛋白：

　 1）使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作為陽性對照，確認實驗條件和試劑均沒有問題。

　 2）可使用Phos-tag^® Biotin檢測樣品中是否有磷酸化蛋白。確認有磷酸化蛋白后，再通過Phos-tag^® SDS-PAGE進行分離鑒定。

　 3）經質譜鑒定有表達磷酸化蛋白，建議增大樣品的含量，可使用Phos-tag^® Agarose進行磷酸化蛋白的富集。磷酸化蛋白含量過低，會影響其分離效果。

　 4）文獻報道有表達磷酸化蛋白，或者同源蛋白有表達磷酸化蛋白的，建議用Phos-tag^® Biotin先確認 樣品中是否有磷酸化蛋白。

　 5）建議樣品的pH值在7左右。酸性或者堿性條件下，^{二價錳離子} -Phos-tag^® 與磷酸化基團的特異性結合較差。

　 6）避免樣品中含有高濃度的還原劑，變性劑，表面活性劑等。β-巰基乙醇濃度不高于0.2 M（或者5%）。

　 7）進行Phos-tag^® SDS-PAGE的合適樣品是純化的蛋白。如果是細胞裂解液，體外激酶反應液，組織均漿液等，需要摸索合適的分離膠，Phos-tag^® Acylamide的濃度。建議Phos-tag^® Acrylamide濃度從50 μM開始摸索。

 

5.    Phos-tag^® SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實驗的優化建議：

1)可以檢測的樣品包括體外激酶反應體系，細胞裂解液，組織均漿液。

2) 每孔樣品的上樣量是10~30 微克（請根據蛋白表達量進行調整）

3) 制備樣品中含有的還原劑、變性劑、螯合劑、釩酸等會使電泳條帶發生彎曲或者拖尾。通過TCA沉淀或滲析法降低雜質含量。

4）建議樣品的pH值在7左右。如果加入上樣緩沖液后溶液顯黃色或者橙色，加入Tris緩沖液調整pH值為7。

5）目的蛋白分子量大于60 kDa，分離膠的丙烯酰胺濃度為6%；目的蛋白分子量小于60 kDa,分離膠的丙烯酰胺濃度為8%。

6）如果樣品中含有大量蛋白，比如細胞裂解液，組織均漿液，Phos-tag^®乙酰胺濃度為5~25 uM。若目的蛋白濃度低，建議Phos-tag^® 乙酰胺濃度為100 uM。

7）Phos-tag^® SDS-PAGE凝膠用于Western Blotting實驗，濕法轉膜建議：10 mM EDTA的轉移緩沖液處理凝膠10 分鐘，不含有EDTA的轉移緩沖液處理凝膠10 分鐘。重復3次。強烈建議濕法轉膜

8）Phos-tag^® SDS PAGE半干法轉膜建議：

  i.電泳后用含有EDTA的轉移緩沖液處理凝膠，EDTA的濃度為 100 mM。100 mM EDTA的轉移緩沖液處理凝膠10 分鐘，不含有EDTA的轉移緩沖液處理凝膠10 分鐘。重復3次。

  ii.轉膜的電流值提高2%~3%, 延長時間2成。

  iii.轉膜的緩沖液加SDS，加到大約0.05~0.2%，轉膜效率會提高。

9）使用目的蛋白的非磷酸化抗體即可。比如檢測各種腫瘤細胞系中Src激酶活性實驗，用Src的非磷酸化抗體即可。

10)和光的WIDE-VIEW^™ Prestained Protein Siza MarkerIII(230-02461)可檢測作為轉膜效率，但是無法判斷分子量。

11）一般預染的蛋白marker在Phos-tag^® SDS-PAGE中條帶會彎曲，無法判斷蛋白分子量。

12）不能確認磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的分離，請進行常規的SDS-PAGE，Western Blotting實驗。比對目的蛋白的遷移率。

13）不能確認是因為蛋白發生磷酸化還是出現降解造成蛋白條帶遷移，請進行常規的SDS-PAGE實驗，確認不會出現條帶遷移。

14）目的蛋白磷酸化與非磷酸化分離效果不佳，使用α-Casein, from Bovine Milk, Dephosphorylated（038-23221）作為陽性對照，確認實驗條件和試劑均沒有問題。如果確認能夠分離，調整分離膠， Phos-tag^® Acylamide的濃度。建議使用品質佳的氯化錳（139-00722）。