Piezo1‐Mediated Mechanotransduction Contributes to Disturbed Flow‐Induced Atherosclerotic Endothelial Inflammation

Keywords: Piezo1; atherosclerosis; endothelial cells; inflammation; shear stress.

動(dòng)脈粥樣硬化與心肌梗塞和中風(fēng)密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種始于內(nèi)皮細(xì)胞（EC）活化的慢性炎癥性疾病。血流剪切應(yīng)力是指流動(dòng)的血液對(duì)血管表面施加的摩擦力。在動(dòng)脈樹(shù)的直線區(qū)域中由單向流動(dòng)產(chǎn)生的層流剪切應(yīng)力（LSS）是抗動(dòng)脈粥樣硬化的，而由動(dòng)脈分支或彎曲處的擾動(dòng)流（DF）產(chǎn)生的振蕩剪切應(yīng)力（OSS）是致動(dòng)脈粥樣硬化的。如果長(zhǎng)期暴露于 DF，EC 炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，尤其是血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）和細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達(dá)會(huì)增加。內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥激活最終會(huì)促進(jìn)并加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

Piezo1 是一種機(jī)械敏感蛋白，能夠?qū)C(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物反應(yīng)，其廣泛表達(dá)賦予 ECs 對(duì)血流剪切應(yīng)力刺激的及時(shí)響應(yīng)，這是血管各種生理和病理過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而，人們對(duì) Piezo1 在心血管系統(tǒng)中的生物力學(xué)傳感作用知之甚少，尤其是在動(dòng)脈粥樣硬化中，這與血流的剪切應(yīng)力密切相關(guān)。

最近，在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，評(píng)估了 Piezo1 在體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。該團(tuán)隊(duì)揭示了 Piezo1 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中上調(diào)，特別是在暴露于擾動(dòng)流的 ECs 中；體外實(shí)驗(yàn)表明，Piezo1 直接感應(yīng) OSS 的刺激，介導(dǎo) Ca2+ 的內(nèi)流并激活內(nèi)皮炎癥。從機(jī)制上講，Piezo1 通過(guò) Ca2+/CaM/CaMKII 通路激活粘著斑激酶（FAK）和 Src，導(dǎo)致 S127 位點(diǎn)的去磷酸化和 YAP（yes 相關(guān)蛋白）的核易位，最終觸發(fā)內(nèi)皮炎癥。研究成果發(fā)表在 Journal of the American Heart Association 期刊題為“Piezo1‐Mediated Mechanotransduction Contributes to Disturbed Flow‐Induced Atherosclerotic Endothelial Inflammation"。

首先，實(shí)驗(yàn)檢查了高脂飲食的動(dòng)脈粥樣硬化 apoE-/- 小鼠主動(dòng)脈中 Piezo1 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其Piezo1 水平顯著上調(diào)。免疫熒光染色進(jìn)一步顯示，Piezo1 上調(diào)，主要與動(dòng)脈粥樣硬化病變中的內(nèi)皮細(xì)胞共定位。然后驗(yàn)證了 Piezo1 高表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化 DF 的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與主動(dòng)脈弓的外曲率（層流區(qū)域）相比，主動(dòng)脈弓的內(nèi)曲率（擾動(dòng)流區(qū)域）表現(xiàn)出更高水平的 Piezo1。為了進(jìn)一步證實(shí)上述發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建apoE-/- 小鼠部分頸動(dòng)脈結(jié)扎模型，局部產(chǎn)生 DF 和 OSS 以加速動(dòng)脈粥樣硬化，發(fā)現(xiàn)與未結(jié)扎的層流側(cè)相比，暴露于結(jié)扎側(cè)頸動(dòng)脈擾動(dòng)流中的 ECs 表現(xiàn)出更高水平的 Piezo1。這表明，Piezo1 在 ApoE-/- 小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和擾動(dòng)流暴露的內(nèi)皮區(qū)域中高表達(dá)。

為了探索 Piezo1 在體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化中的功能，對(duì)高脂飲食的apoE-/- 小鼠注射 GsMTx4（Piezo1 抑制劑），評(píng)估Piezo1 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的長(zhǎng)期影響。油紅 O 染色和蘇木精-伊紅染色顯示，注射 GsMTx4 后，小鼠的總體斑塊負(fù)荷和主動(dòng)脈根部斑塊面積顯著減少（圖1 A-D）。然后，通過(guò)頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo) DF 動(dòng)脈粥樣硬化模型，驗(yàn)證 Piezo1 在 DF 相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。同樣發(fā)現(xiàn)，抑制 Piezo1 顯著降低了與 DF 相關(guān)的頸動(dòng)脈斑塊病變的進(jìn)展（圖1 E、F）。

此外，還探討了 Piezo1 在內(nèi)皮炎癥中的作用。顯然，Piezo1 抑制劑減弱了動(dòng)脈粥樣硬化炎癥標(biāo)志物 VCAM-1 和 ICAM-1 的表達(dá)（圖1 G-I）。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)（圖1 J、K）。在部分頸動(dòng)脈結(jié)扎模型中，DF 誘導(dǎo)的 VCAM-1 過(guò)表達(dá)被Piezo1 的抑制逆轉(zhuǎn)（圖1 L、M）。這些結(jié)果表明，抑制 Piezo1 可延緩長(zhǎng)期和擾動(dòng)流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展和內(nèi)皮炎癥。

圖1    抑制 Piezo1 可延緩長(zhǎng)期和擾動(dòng)流誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展和內(nèi)皮炎癥。

接下來(lái)，為了研究 Piezo1 在 ECs 中如何響應(yīng) DF 發(fā)揮作用，將體外 HUVECs 組裝到平行板流通室中，并加載 OSS（0.5±4 dyn/cm2），模擬作用于血管內(nèi)膜的 DF 刺激。當(dāng)保持靜態(tài)時(shí)，Piezo1 在 HUVECs 中擴(kuò)散分布，但當(dāng)受到 OSS 刺激時(shí)，出現(xiàn)局部高密度堆積（圖2 A）。考慮到Piezo1 激活時(shí) Ca2+ 可滲透性，因此檢測(cè)了 Ca2+ 內(nèi)流以評(píng)估 OSS 是否可以激活 Piezo1。結(jié)果顯示，與靜態(tài)狀態(tài)相比，OSS 刺激促進(jìn)細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 積累，這與 LSS 和 Piezo1 激動(dòng)劑 Yoda1 的作用一致，但與抑制劑 GsMTx4 相反（圖2 B-C）。

然后，在 HUVECs中進(jìn)行 Piezo1 靶向沉默。Piezo1 沉默顯著抑制 OSS 介導(dǎo)的 Ca2+內(nèi)流（圖2 D-E）。隨后，將注意力轉(zhuǎn)向 Piezo1 在 OSS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥中的作用，發(fā)現(xiàn)OSS 增加了內(nèi)皮炎癥標(biāo)志物 VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 水平，然而，Piezo1 的缺失部分抵消了這種效應(yīng)（圖2 F-G）。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，Piezo1 響應(yīng) OSS 促進(jìn)內(nèi)皮炎癥激活。

根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，繼續(xù)研究 Piezo1 與內(nèi)皮炎癥之間的潛在聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，YAP 是一種 OSS 敏感的轉(zhuǎn)錄因子，可被 OSS 激活以觸發(fā)內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化。研究發(fā)現(xiàn)，OSS 誘導(dǎo) YAP 在絲氨酸 127 位點(diǎn)的時(shí)間依賴性去磷酸化。免疫熒光染色也顯示暴露于 OSS 后 HUVECs 中具有強(qiáng)烈的 YAP 核定位。然而，當(dāng) Piezo1 被刪除時(shí)，發(fā)現(xiàn) OSS 誘導(dǎo)的 YAP 激活被部分抑制，證明 YAP 是 Piezo1 的重要下游因子。

與體外結(jié)果一致，體內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)，部分頸動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的 DF 導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中 YAP 表達(dá)更高，而 Piezo1 抑制劑 GsTMx4 減輕了 YAP 的上調(diào)。挽救實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Piezo1 沉默介導(dǎo)的 VCAM-1 和 ICAM-1 的下調(diào)被 YAP 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)。這表明，Piezo1 通過(guò) YAP 激活促進(jìn)內(nèi)皮炎癥。

圖2    Piezo1 響應(yīng)振蕩剪切應(yīng)力促進(jìn)內(nèi)皮炎癥激活。

Piezo1 如何將 OSS 機(jī)械信號(hào)傳輸給 YAP 引起了研究人員的注意。FAK 和 Src 激酶家族在細(xì)胞機(jī)械信號(hào)傳感中起著重要作用。以往研究證實(shí)Piezo1 激活可調(diào)節(jié) FAK 活性，因此，實(shí)驗(yàn)研究了 FAK/Src 是否參與 HUVECs 中 OSS 介導(dǎo)的 Piezo1 激活。結(jié)果表明，Piezo1 的缺失降低了 OSS 和 Yoda1 誘導(dǎo)的 Tyr397（p-FAK Y397）和 Tyr419（p-Src Y419）位點(diǎn)的 FAK 磷酸化水平。免疫沉淀和熒光共定位分析顯示，Piezo1 缺失降低了 FAK/Src 的共沉淀和共定位，表明 Piezo1 影響 FAK/Src 的結(jié)合。

已知 FAK 和 Src 可在機(jī)械反應(yīng)中激活 YAP。因此，推測(cè)抑制 FAK 和 Src 激酶活性可能會(huì)挽救 Piezo1 誘導(dǎo)的 YAP 激活和炎癥表型。與此一致，用 FAK 抑制劑（PF-573228）和 Src 抑制劑（PP2）處理減少了 Yoda1 誘導(dǎo)的 YAP S127 去磷酸化和 VCAM-1 表達(dá)。這表明，Piezo1 通過(guò) FAK/Src 激酶激活 YAP。

鑒于 Piezo1 通道的激活允許大量的 Ca2+內(nèi)流，經(jīng)典的鈣信號(hào)通路 Ca2+/CaM/CaMKs（Ca2+/calmodulin/calmodulin‐dependent protein kinases）可能是 Piezo1 激活與其下游事件之間的重要聯(lián)系。將CaMKK 抑制劑 STO-609和CaMKII 抑制劑 KN-93 分別添加到 HUVECs 中，發(fā)現(xiàn)只有 KN-93 抵消了 Piezo1 介導(dǎo)的 YAP S127 去磷酸化（圖3 A、B）。此外，用 Ca2+ 螯合劑 BAPTA、CaM 抑制劑 Trifluoperazine 和 CaMKII 抑制劑 KN-93處理 HUVECs。結(jié)果顯示，Yoda1 誘導(dǎo)的 YAP 去磷酸化和 VCAM-1 表達(dá)被 Ca2+/CaM/CaMKII 抑制劑抑制（圖3 C-E）。

最后，進(jìn)一步測(cè)試 Ca2+/CaM/CaMKII 和 FAK/Src之間的聯(lián)系，將HUVECs 用 Ca2+、CaM 和 CaMKII 抑制劑處理，并評(píng)估 FAK 和 Src 的磷酸化，發(fā)現(xiàn) FAK 和 Src 的磷酸化受到抑制（圖3 F-H）。此外，抑制 CaMKII 激酶活性導(dǎo)致 FAK 和 Src 之間的相互作用減弱（圖3 I-J）。這些數(shù)據(jù)表明，Piezo1 介導(dǎo)的 YAP 激活和內(nèi)皮炎癥依賴于 Ca2+/CaM/CaMKII‐FAK/Src 軸。

圖3    Piezo1 介導(dǎo)的 YAP 激活和內(nèi)皮炎癥依賴于 Ca2+/CaM/CaMKII‐FAK/Src 軸。

圖4     Piezo1 響應(yīng) OSS 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化性內(nèi)皮炎癥的示意圖。

致動(dòng)脈粥樣硬化 DF/OSS 激活內(nèi)皮 Piezo1。Piezo1 的激活允許 Ca2+ 內(nèi)流，隨后激活 Ca2+/CaM/CaMKII 信號(hào)通路和下游激酶 FAK/Src。這個(gè)過(guò)程有導(dǎo)致 YAP S127 去磷酸化，并最終觸發(fā)內(nèi)皮炎癥，推動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

綜上所述，該研究表明，Piezo1 可能是動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)。研究闡明了 Piezo1 在 OSS 介導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，確定了 Piezo1-Ca2+/CaM/CaMKII-FAK/Src-YAP 軸作為一種新的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。然而，目前尚不確定其他因素，例如膜受體串?dāng)_、銜接蛋白和激酶之間的相互作用以及其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同或抑制作用，是否也參與 Piezo1 介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。構(gòu)建更完整的內(nèi)皮機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)值得未來(lái)進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)：Lan Y, Lu J, Zhang S, Jie C, Chen C, Xiao C, Qin C, Cheng D. Piezo1-Mediated Mechanotransduction Contributes to Disturbed Flow-Induced Atherosclerotic Endothelial Inflammation. J Am Heart Assoc. 2024 Nov 5;13(21):e035558. doi: 10.1161/JAHA.123.035558. Epub 2024 Oct 25. PMID: 39450718.

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