The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions

KWS：TNFSF12/TWEAK；Colonic Inflammatory Fibroblast；Differentiation；Monocyte；Cell Coculture

炎癥性腸病（IBD）是潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩病（CD）兩種病癥的總稱，在不同的疾病階段和致病性情況下均發現了炎癥成纖維細胞。成纖維細胞特征和功能的改變成為 IBD 的關鍵影響因素，驅動致病性成纖維細胞功能的介質可能是治療干預的希望靶點。

驅動成纖維細胞-免疫細胞通訊的介質和分子機制才剛開始被闡明。TNF 超家族（TNFSF）成員14（TNFSF14），也稱為 LIGHT，被鑒定為一種成纖維細胞衍生因子，會抑制腸道類器官的生長。重要的是，TNFSF 的各種因子，包括TNFSF14、TNFSF12（也稱為 TNF 相關的凋亡弱誘導劑TWEAK）或 TNFSF15 ，最近在臨床前模型中確認與 IBD 和纖維化有關。

基于此，愛爾蘭都柏林大學學院Conway生物分子與生物醫學研究所的聯合團隊在一項研究中，集中探討了 TWEAK 作為結腸成纖維細胞分化介質的潛力，并分析了其在成纖維細胞-單核細胞相互作用中的參與。研究發現TWEAK 具有作為轉錄抑制因子和誘導因子的雙重作用，導致成纖維細胞分化為炎癥細胞，并利用共培養模型探索了炎性成纖維細胞調節免疫細胞反應的潛力，發現暴露于 TWEAK 處理的人結腸成纖維細胞的 THP-1 單核細胞粘附并增加炎癥標志物的表達。這些數據表明了 TWEAK 促進結腸炎性成纖維細胞分化和成纖維細胞-單核細胞相互作用。研究成果發表于 The Journal of Immunology 期刊題為“The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions"。

首先，為了測試 TWEAK 在結腸成纖維細胞分化中的作用，將原代人結腸成纖維細胞用 TWEAK 處理評估轉錄譜的變化。差異表達基因揭示了超過1200 基因的失調，而 TWEAK 作為基因誘導因子和抑制因子的作用相似，有 692 個誘導基因和 579 個抑制基因，其中上調的轉錄組由與炎癥相關的基因填充（圖1 A）。

值得注意的是，與抗原（Ag）呈遞相關的幾個過程，如 TAP1 結合和 MHC 蛋白結合，也在 TWEAK 上調數據集中富集，還上調了許多參與 Ag 加工和呈遞以及對感染因子反應的基因（圖1 B、D）。同時，TWEAK 促進了細胞因子（包括 IL-1B、IL-6、IL-12A、IL-15 或 IL-33）、趨化因子、免疫受體、TNFSF 介質/受體/接頭、細胞粘附分子的基因表達（圖1 C）。TWEAK 還誘導了基質重塑介質和炎性成纖維細胞標志物的表達，降低血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα）的表達（圖1 E）。這些數據表明，TWEAK 介導結腸成纖維細胞分化為不同的致病特征，促進參與炎癥和 Ag 呈遞的基因的表達，增加參與基質重塑的基因，并可能使參與上皮穩態的基因失調。

以往研究將結腸基質細胞分為四類，其中基質4（S4）亞群被確定為炎癥群體，該亞群在正常結腸標本中幾乎不存在，而在 UC 活檢中增加。鑒于結腸成纖維細胞中 TWEAK 誘導的轉錄組的炎癥性質，研究人員假設這類似于先前在 UC 中鑒定的 S4 亞群。為此，展開了一項比對研究，將 TWEAK 上調和下調的轉錄組與這四個基質群體中的每一個進行比較，發現TWEAK 誘導的反應與 S4 的同源性最高。與先前在 IBD 患者活檢中報道的 TWEAK 受體（TNFRSF12/Fn14）的高表達一致，對 Fn14 在細胞群中的表達分析表明，該基因在 S4 細胞中dute存在，而 TWEAK 本身不被任何基質群表達。因此，TWEAK 在結腸成纖維細胞中誘導炎癥轉錄程序，該程序與 UC 中的炎性成纖維細胞亞群部分一致。

圖1   TWEAK誘導結腸成纖維細胞的炎癥譜。

鑒于 TWEAK 介導的 ICAM-1 和 VCAM-1 上調，以及 CCL2 的高分泌，實驗假設 TWEAK 誘導的炎性成纖維細胞促進單核細胞募集或激活。

接下來，為了研究它們的相互作用，將原代結腸成纖維細胞與THP-1細胞共培養，單培養的THP-1細胞（vehicle- 或TWEAK-）作為對照。與成纖維細胞共培養導致大量 THP-1 細胞粘附，從而形成兩個細胞組分，以下稱為懸浮和粘附組分（圖2 A）。有趣的是，與成纖維細胞共培養上調懸浮 THP-1 細胞中粘附分子 CD11b的表達，表明該細胞組分也由與成纖維細胞共培養引發，盡管這僅通過用 TWEAK 預處理而略微增加（圖2 B、C）。相反，THP-1 細胞的活力不受 TWEAK 的影響，且在單培養和共培養之間沒有差異。

然后繼續分析了 TWEAK 誘導的成纖維細胞對極化募集的單核細胞/巨噬細胞的可能性。CD14 是一種在單核細胞和巨噬細胞中發現的標志物，在單培養懸浮的 THP-1 細胞中表達極少，相反，在共培養物的懸浮 THP-1 中 CD14^high 細胞顯著增加，這在與 TWEAK 處理的成纖維細胞的共培養物中進一步富集（圖2 D、E）。有趣的是，CD14 表達也在暴露于 TWEAK 處理的結腸成纖維細胞條件培養基的 THP-1 細胞中被誘導，但程度低于直接共培養（圖2 E）。此外，與 TWEAK 處理的成纖維細胞共培養的細胞中，ICAM-1^high THP-1 的頻率更高（圖2 F、G），熱圖分析還顯示ICAM-1^high 和 CD14^high  THP-1 之間存在相關性（圖2 F）。

進一步分析 THP-1 的貼壁部分，使用 CCR2 （在 THP-1 上高表達，在結腸成纖維細胞上缺失）和 CD90 （成纖維細胞標志物，在THP-1 上缺失）來區分粘附共培養中的兩個細胞組分（圖2 H）。實驗觀察到，與具有 CCD-18Co（圖2 H、I）和 PB-H-6231的正常結腸成纖維細胞相比，TWEAK 處理的成纖維細胞共培養中粘附 CCR2^high CD90^- 細胞（原始巨噬細胞）數量顯著增加，表明 TWEAK 刺激促進了成纖維細胞募集和粘附單核細胞的能力。有趣的是，與懸浮部分中的 THP-1 一樣，粘附的 CCR2^high CD90^- 細胞的 CD14 水平明顯更高（圖2 J、K）。同樣，盡管 TWEAK 在 THP-1 或成纖維細胞單培養物中未能上調 CXCL1 或 IL-8 的分泌，但與未處理的成纖維細胞共培養相比，THP-1/TWEAK 誘導的成纖維細胞共培養物中兩種趨化因子均顯著增加（圖2 L）。這些數據表明，THP-1 細胞與結腸成纖維細胞共培養可促進其粘附、活化和趨化因子分泌，當用 TWEAK 預刺激成纖維細胞時，這種效應會增強。

圖2   TWEAK 誘導的成纖維細胞募集并極化 THP-1 細胞。

發現 TWEAK 處理的結腸成纖維細胞促進 THP-1 粘附和分化后，又研究了原代單核細胞是否會表現出類似的反應，使用上述共培養模型，將原代單核細胞與結腸成纖維細胞進行單培養或共培養。與 THP-1 相反，觀察到大多數單核細胞粘附在培養物中，無論是否存在成纖維細胞。培養 24 小時后，單培養單核細胞中 CCR2 的表達明顯高于共培養，而在與  TWEAK處理的成纖維細胞共培養中CCR2 的表達zuidi，這可能代表一種單核細胞-巨噬細胞中介。

中度和高度表達 CD16 的單核細胞的頻率比較顯示，與單獨的單核細胞相比，TWEAK 刺激的成纖維細胞共培養的原代單核細胞從 CD16^high 相對轉變為 CD16^int（表示為 CD16^int/CD16^high 的比率）。此外，與正常成纖維細胞相比，TWEAK 處理的成纖維細胞共培養中 TREM-1^high （結腸炎模型和 CD 患者中致病性巨噬細胞的標志物）單核細胞的頻率顯著增加。這些數據表明，TWEAK 處理的成纖維細胞促進原代單核細胞分化和活化，表現為CCR2 和 CD16 表達的降低、TREM-1 表達的增加以及 CXCL1 和 CXCL10 趨化因子分泌的增加。

最后，研究人員對 TWEAK/S4 共同轉錄組進行了額外的String分析，重點關注信號傳導介質、細胞因子和趨化因子（圖3 A）。信號介質包括非經典 NF-κB RELB 和 NFKB2 的兩個主要效應子，發現 TWEAK 在蛋白質水平上誘導非經典 NF-κB 前體 p100 裂解成 p52，從 4 小時開始，在 24-48 小時之間達到峰值（圖3 B）。

鑒于上述發現，測試了非經典 NF-κB 信號的選擇性抑制是否可以消除 TWEAK 誘導的結腸成纖維細胞的炎癥分化。實驗發現，用 NIK 抑制劑 SMI1 處理阻斷了 TWEAK 介導的 VCAM-1 表達上調（圖3 C）和 CCL2 分泌（圖3 D），但它不影響 ICAM-1（圖3 C），這表明對 TWEAK 的反應可能由多種信號通路協調。

此外，研究人員假設，抑制 TWEAK 介導的非經典 NF-κB 信號可以調節結腸成纖維細胞和單核細胞之間的相互作用，阻斷后者的炎癥極化。結果發現，當用 NIK SMI1 處理成纖維細胞時，CD14^high THP-1 細胞群在與 TWEAK 誘導的成纖維細胞共培養中減少（圖3 E、F），與正常結腸成纖維細胞共培養中的水平相似，表明NIK 抑制劑至少部分損害了 TWEAK 誘導的成纖維細胞極化 THP-1 細胞的能力。這些數據表明，TWEAK通過非典型NF-κB介導結腸成纖維細胞炎癥分化和單核細胞極化。

圖3    非經典 NF-κB 調節 TWEAK 引發的成纖維細胞和單核細胞之間的相互作用。

圖4    圖形概要

TNFSF12/TWEAK 誘導結腸成纖維細胞的炎癥特征。TWEAK 處理的成纖維細胞促進單核細胞粘附和炎性極化。抑制非經典 NF-κB 通路部分阻斷了這種相互作用。

綜上所述，該研究提供的數據揭示了 TWEAK 作為結腸成纖維細胞炎癥分化介質的重要作用，誘導與先前在 UC 患者中發現的炎癥成纖維細胞一致的轉錄程序。通過細胞系、原代單核細胞和共培養模型，研究發現 TWEAK 刺激的結腸成纖維細胞促進單核細胞的粘附和分化，改變關鍵炎癥標志物如 CD14、CD16 或 TREM-1 的表達，并增強炎癥趨化因子的分泌。這項研究將 TWEAK/Fn14 軸定位為腸道炎癥中成纖維細胞-單核細胞相互作用的新興調節因子，以及調節 IBD 中致病性成纖維細胞功能的有吸引力的治療靶點。

參考文獻：Matellan C, Kennedy C, Santiago-Vela MI, Hochegger J, Ní Chathail MB, Wu A, Shannon C, Roche HM, Aceves SS, Godson C, Manresa MC. The TNFSF12/TWEAK Modulates Colonic Inflammatory Fibroblast Differentiation and Promotes Fibroblast-Monocyte Interactions. J Immunol. 2024 Jun 15;212(12):1958-1970. doi: 10.4049/jimmunol.2300762. PMID: 38700420; PMCID: PMC11149899.

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