Paracrine- and cell-contact-mediated immunomodulatory effects of human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells on CD4+ T lymphocytes

Keywords: CD4+ T lymphocytes; Co-culture; Human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells; IL-1β; Immunomodulation; TNF-α.

從牙周膜分離的間充質基質細胞（hPDL-MSCs）具有很高的治療潛力，這可能是由于它們的免疫調節特性。兩組不同的機制主要負責這些免疫調節能力：（1）可溶性免疫介質和酶的分泌，包括IDO-1、PGE2和TSG-6，它們以旁分泌方式調節免疫細胞；（2）和細胞-細胞直接接觸機制，通過表達膜結合免疫介質，包括PD-L1和 PD-L2。這些免疫調節機制在穩態條件下通常較低，但在炎癥環境中會通過各種促炎細胞因子，包括IL-1β 和TNF-α 得到增強。由于免疫細胞是這些促炎細胞因子的主要來源，這導致 hPDL-MSCs 和免疫細胞之間存在緊密的雙向相互作用。

大多數關于這種相互關系的知識都來自體外研究，主要使用兩種不同的模型，即直接共培養模型和間接共培養模型，將 hPDL-MSCs 與免疫細胞共培養。MSCs 與 T 淋巴細胞的相互作用是研究最多的免疫調節作用之一。大量研究已表明，hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細胞增殖的抑制作用，以及觸發和抑制調節性 CD4+ T 淋巴細胞（Tregs）和 CD4+ Th17 淋巴細胞分化的能力。然而，目前還沒有研究直接比較 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細胞相互作用背景下的共培養模式。

最近，維也納醫科大學牙學院牙周病臨床和牙周科研中心課題組的一項體外研究旨在不同細胞因子環境中使用直接和間接共培養模型比較 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細胞之間的雙向相互作用。研究結果顯示，共培養模型不同程度地影響 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細胞之間的相互作用，表明旁分泌和直接細胞間免疫調節機制都有助于觀察到 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細胞的免疫調節活性。這似乎源于 hPDL-MSCs 中免疫介質表達的可變性，具體取決于共培養模型和當前的細胞因子類型。研究成果發表于 Stem Cell Research & Therapy 期刊題為“Paracrine- and cell-contact-mediated immunomodulatory effects of human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells on CD4+ T lymphocytes"。

首先，比較了三種不同體外共培養模型（圖1 A）下hPDL-MSCs對CD4+ T淋巴細胞增殖（圖1 B、D、E）和活力（圖1 C）的影響，發現hPDL-MSCs 在所有三種體外共培養模型中均顯著降低 CD4+ T 淋巴細胞增殖（圖1 B）。在無插入物的間接和直接共培養中，分裂的 CD4+ T 淋巴細胞減少（圖1 D、E）。這些基于 hPDL-MSCs 的抑制作用在有或沒有插入物的直接體外共培養模型中明顯強于間接共培養模型（圖1  B）。此外，間接共培養的 hPDL-MSCs 顯示出抗細胞死亡作用，而沒有插入物的直接共培養可導致死亡 CD4+ T 淋巴細胞的顯著增加（圖1 C）。這些數據表明，hPDL-MSCs 抑制 CD4+ T 淋巴細胞的能力取決于所使用的共培養模型。

此外，對CD4+ T 淋巴細胞中細胞因子產生影響的觀察發現，在間接共培養模型中，hPDL-MSCs 顯著降低了 TNF-α、IL-10、IL-22、IL-5、IL-13 和 IL-9 的水平；在插入物的直接模型中，TNF-α 和 IFN-γ 被 hPDL-MSCs顯著降低，但與上述程度不同；IL-4 水平在兩種帶有插入物的共培養模型中均顯著增加，并在直接共培養模型中明顯更高；無插入物的直接共培養導致 TNF-α 顯著降低；相比之下，IL-10、IL-17A、IL-17F 和 IL-4 水平顯著增加。這些數據表明，hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細胞中細胞因子產生的能力也取決于體外共培養模型。

圖1    hPDL-MSCs抑制CD4+ T淋巴細胞的能力取決于共培養模型。

實驗還研究了不同體外共培養模型下白細胞介素IL-1β 觸發的 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細胞增殖和活力的影響（圖2 A-J）。IL-1β的存在顯著增強了hPDL-MSCs對PHA- 激活的CD4+ T淋巴細胞增殖的抑制作用（圖2 A、B）。在 IL-1β 存在下，無插入物的直接共培養顯示 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細胞增殖沒有明顯影響，然而，在無插入物的直接共培養中，IL-1β 處理的hPDL-MSCs顯著抵消了hPDL-MSCs介導的細胞死亡誘導效應（圖2 C、D）。這些數據表明，IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細胞增殖和活力的能力取決于所使用的共培養模型。

此外，帶有插入物的間接和直接共培養模型中，IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細胞的細胞因子分泌譜產生相似的影響：TNF-α、IL-10、IL-5、IL-13和 IL-9 顯著降低，而 IL-17A 和 IL-17F 顯著上調；IL-22 和 IL-4 在帶有插入物的間接和直接共培養模型中分別上調和下調，而 IFN-γ 在兩種共培養模型中均無顯著變化。相比之下，CD4+ T 淋巴細胞與 IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 直接共培養顯著觸發了所有研究的細胞因子水平的升高，除了IL-13 。這些數據表明，IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細胞中細胞因子產生的能力取決于體外共培養模型。

同樣，對于腫瘤壞死因子 TNF α觸發的 hPDL-MSCs 對 CD4+ T 淋巴細胞增殖和活力的影響，數據也表明，TNF α處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細胞增殖和活力的能力以及改變CD4+ T淋巴細胞生成細胞因子的能力均取決于共培養模型。

圖2   IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 影響 CD4+ T 淋巴細胞增殖和活力的能力取決于所使用的共培養模型。

CD4+ T淋巴細胞與未處理或IL-1β 處理的hPDL-MSCs孵育5 天后，基于CFSE（A、B、E-J）和PI（C、D）染色，流式細胞術檢測增殖和活力。

最后，實驗還研究了不同類型共培養實驗結束時 hPDL-MSCs 中免疫介質基因表達的水平。與單培養相比，無論使用何種體外共培養模型，hPDL-MSCs 中所有研究的免疫介質的基因表達水平都顯著增加（圖3 A-E），但無插入物的直接共培養中的 TSG-6 除外（圖3 C）。IDO-1（圖3 A）、TSG-6（圖3 C）和 CD274 （圖3 E）的水平在兩種直接共培養模型中降低。此外，PTGS-2 基因表達（圖3 B）在有插入物的直接共培養模型中顯著降低，相比之下，無插入物的直接共培養模型導致 PTGS-2 水平顯著增加。CD273 在各種體外共培養模型之間未觀察到差異（圖3 D）。這些數據表明，共培養模型的類型會影響 hPDL-MSCs 中免疫介質基因表達。

此外，當外源性 IL-1β 存在下，其對可溶性免疫介質（IDO-1、PTGS-2、TSG-6）的基因表達水平的影響與共培養模型無關，但IL-1β 在間接與直接共培養中分別導致 CD273 的增加和減少。IL-1β 處理的 hPDL-MSCs 與 CD4+ T 淋巴細胞直接共培養，在有和沒有插入物時，CD274 表達分別降低和增加，在間接共培養模型中未觀察到對 CD274 基因表達的影響。盡管這些數據表明了一些趨勢，但未觀察到膜結合免疫介質基因表達水平的顯著差異。這些數據表明，在外源性 IL-1β 存在下，體外共培養模型類型對hPDL-MSCs中膜結合免疫介質（而非可溶性免疫介質）的影響不同。

同樣，在 TNF-α 處理的 hPDL-MSCs 中，體外共培養模型類型對hPDL-MSCs中可溶性和膜結合免疫介質的基因表達也均有不同的影響。

圖3     免疫介質基因在hPDL-MSCs中的表達隨共培養模式的不同而改變。

總之，該研究表明共培養模型對 CD4+ T 淋巴細胞增殖、活力和細胞因子分泌等結果有顯著影響。在未處理和細胞因子處理的hPDL-MSCs中觀察到這些不同的效應，可能是由不同共培養的hPDL-MSCs的免疫調節機制的可變性引起的。總而言之，這些差異可能源于共培養模型允許 hPDL-MSCs 和 CD4+ T 淋巴細胞之間發生不同的雙向相互作用（旁分泌+ 直接細胞間接觸或僅旁分泌）的事實。盡管直接共培養模型zuishihe模擬體內情況，但間接共培養模型可以區分旁分泌和直接細胞間接觸免疫調節機制。因此，并行使用不同的共培養模型并直接比較結果將提供有關所涉及的免疫調節機制的信息，這將成為未來良好的科學實踐。

參考文獻：Behm C, Mi?ek O, Rausch-Fan X, Moritz A, Andrukhov O. Paracrine- and cell-contact-mediated immunomodulatory effects of human periodontal ligament-derived mesenchymal stromal cells on CD4+ T lymphocytes. Stem Cell Res Ther. 2024 May 31;15(1):154. doi: 10.1186/s13287-024-03759-4. PMID: 38816862; PMCID: PMC11141051.

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