Osteocytes regulate bone anabolic response to mechanical loading in male mice via activation of integrin α5

Subject terms: Bone, Bone quality and biomechanics

機(jī)械敏感的骨組織根據(jù)機(jī)械負(fù)荷調(diào)整其結(jié)構(gòu)。骨細(xì)胞（Osteocytes）是骨組織中主要的機(jī)械感覺(jué)細(xì)胞，可以檢測(cè)來(lái)自腔隙-小管網(wǎng)絡(luò)的機(jī)械信號(hào)，并將骨合成代謝分子釋放到骨基質(zhì)中，以調(diào)節(jié)骨表面的骨重塑。

整合素由 α 和 β 亞基組成，在細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在骨細(xì)胞中，整合素α5 被證明可以調(diào)節(jié)間隙連接蛋白43（Cx43）的表達(dá)并通過(guò)接頭蛋白 14-3-3θ 與 Cx43 在質(zhì)膜上共組裝，形成機(jī)械敏感的 Cx43 半通道復(fù)合物。在流體流動(dòng)剪切應(yīng)力（FFSS）下，整合素α5 直接與 Cx43 相互作用，在骨細(xì)胞上打開(kāi) Cx43 半通道。開(kāi)放的 Cx43 半通道釋放小的合成代謝因子，如骨細(xì)胞中的前列腺素E2（PGE2），它們以自分泌/旁分泌方式發(fā)揮作用并促進(jìn)骨骼合成代謝對(duì)機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)。

基于整合素α5 和 Cx43 半通道之間的相互作用，有理由假設(shè)整合素α5 通過(guò)激活 Cx43 半通道來(lái)促進(jìn)骨骼中機(jī)械刺激的合成代謝功能。因此，西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院及美國(guó)德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心的研究團(tuán)隊(duì)為了確定整合素a5 在骨細(xì)胞中的作用及其在機(jī)械負(fù)荷過(guò)程中的合成代謝功能，構(gòu)建了Itga5 條件性基因敲除（cKO）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞中整合素α5 的缺失阻礙了皮質(zhì)骨和小梁骨對(duì)機(jī)械負(fù)荷的合成代謝反應(yīng)，并進(jìn)一步揭示了機(jī)械負(fù)荷下整合素α5 在激活骨細(xì)胞半通道、PGE2 釋放以及骨重塑中的重要性。研究成果發(fā)表在 Bone Research 期刊題為“Osteocytes regulate bone anabolic response to mechanical loading in male mice via activation of integrin α5"。

首先，研究人員假設(shè)骨細(xì)胞整合素α5 的缺失可能會(huì)降低 Cx43半通道活性并在機(jī)械負(fù)荷期間損害骨骼的合成代謝功能。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，生成了骨細(xì)胞整合素α5 cKO 小鼠。來(lái)自脛骨皮質(zhì)骨組織的染色定量分析發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，cKO小鼠的皮質(zhì)骨中有更多的空骨陷窩；且TUNEL陽(yáng)性骨細(xì)胞增加，TUNEL標(biāo)記也證實(shí)了cKO小鼠中凋亡骨細(xì)胞的顯著增加。

然后對(duì) WT 和 cKO 雄性小鼠進(jìn)行為期 2 周的循環(huán)軸向脛骨壓縮負(fù)荷（0.5N，2Hz）。μCT分析顯示，與WT小鼠相比，cKO小鼠對(duì)側(cè)未加載負(fù)荷脛骨的骨面積分?jǐn)?shù)（B.Ar/T.Ar）和皮質(zhì)骨厚度（Ct.Th）顯著降低（圖1 c、e）。與對(duì)側(cè)對(duì)照脛骨相比，WT小鼠的機(jī)械負(fù)荷增加了 Ct.Th（圖1 e）。雖然負(fù)荷導(dǎo)致骨面積（B.Ar）增加，但由于cKO小鼠對(duì)側(cè)對(duì)照脛骨總橫截面積（T.Ar）的擴(kuò)大（圖1 a、b），骨髓面積的增大（M.Ar）（圖1 d）和皮質(zhì)厚度的減小（圖1 e）導(dǎo)致骨面積比率的損失，如cKO小鼠 B.Ar/T.Ar 降低所示（圖1 c）。因此，在WT小鼠中顯示的由脛骨負(fù)荷誘導(dǎo)的 Ct.Th 和極慣性矩（pMOI）增加，在cKO小鼠中沒(méi)有觀察到（圖1 e、f）。在WT和cKO小鼠的機(jī)械負(fù)載期間，骨密度（BMD）沒(méi)有變化（圖1 g）。與對(duì)側(cè)對(duì)照組相比，WT小鼠的彈性模量和極限應(yīng)力顯著增加，但在cKO小鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種增加（圖1 h、i）。

在干骺端小梁骨中，機(jī)械負(fù)荷增加了cKO和WT小鼠對(duì)側(cè)對(duì)照的骨小梁厚度（Tb.Th）。然而，與對(duì)側(cè)對(duì)照組相比，cKO小鼠在脛骨負(fù)荷下表現(xiàn)出骨小梁數(shù)量（Tb.N）的減少和骨小梁分離度（Tb.Sp）的增加。這些結(jié)果表明，整合素α5參與了皮質(zhì)骨和小梁骨對(duì)機(jī)械負(fù)荷的合成代謝反應(yīng)。

圖1    骨細(xì)胞中整合素α5的缺失減弱或逆轉(zhuǎn)了中軸皮質(zhì)骨機(jī)械負(fù)荷的合成代謝功能。

WT和cKO小鼠未負(fù)荷對(duì)側(cè)脛骨的動(dòng)態(tài)組織形態(tài)學(xué)分析顯示，在骨內(nèi)膜表面，機(jī)械負(fù)荷導(dǎo)致WT對(duì)側(cè)對(duì)照的礦物質(zhì)附著率（MAR）和骨形成率/骨表面（BRF/BS）增加，但在cKO小鼠中這種增加受到抑制（圖2 a、c），且WT小鼠負(fù)荷脛骨的MAR和BFR/BS大于cKO小鼠（圖2 a、c）。然而，脛骨負(fù)荷沒(méi)有觀察到礦化表面/骨表面（MS/BS）的顯著增加，而負(fù)荷的cKO小鼠脛骨則呈下降趨勢(shì)（圖2 b）。代表性圖像顯示，骨內(nèi)膜成骨反應(yīng)集中在后外側(cè)區(qū)域（圖2 g）。與骨內(nèi)膜表面相比，cKO小鼠在骨干 37% 區(qū)域骨外膜表面的MS/BS與WT相比顯著降低（圖2 e）。骨外膜表面的MAR、MS/BS和BFR/BS顯著升高，與cKO和WT小鼠的對(duì)側(cè)對(duì)照相似（圖2 d-f）。這些結(jié)果表明，骨細(xì)胞中整合素α5的缺失減弱了機(jī)械負(fù)荷引起的中軸骨成骨增加。

鑒于在后外側(cè)（PL）表面發(fā)生強(qiáng)烈的骨內(nèi)成骨反應(yīng)，因此，接下來(lái)研究重點(diǎn)分析了該區(qū)域的成骨細(xì)胞。結(jié)果表明，WT小鼠骨內(nèi)膜表面壓縮負(fù)荷誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞顯著增加，但在cKO小鼠中沒(méi)有增加，且與WT小鼠相比，cKO小鼠骨外膜表面的成骨細(xì)胞較少。

由于加載后 M.Ar 在cKO小鼠中增大，實(shí)驗(yàn)假設(shè)這種反應(yīng)部分是由于破骨細(xì)胞活性的增加。正如預(yù)期，在 WT 和 cKO 小鼠中，機(jī)械負(fù)荷增加了前內(nèi)側(cè)（AM）骨內(nèi)膜表面的破骨細(xì)胞，而PL表面的破骨細(xì)胞在機(jī)械負(fù)荷期間沒(méi)有變化。對(duì)側(cè)非負(fù)荷脛骨的分析顯示，cKO小鼠中的破骨細(xì)胞比WT小鼠更多。有趣的是，機(jī)械負(fù)荷顯著增加了cKO小鼠干骺端小梁骨中的破骨細(xì)胞數(shù)量和破骨細(xì)胞覆蓋面。這些數(shù)據(jù)表明，整合素α5在機(jī)械負(fù)荷期間調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活動(dòng)，其缺失抑制負(fù)荷誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞活性增加，但促進(jìn)骨小梁破骨細(xì)胞的活性。

圖2   骨細(xì)胞中整合素α5 缺失抑制機(jī)械負(fù)荷下中軸骨內(nèi)成骨的增加。

最后，為了確定 Cx43 半通道是否參與整合素α5 調(diào)節(jié)的對(duì)軸向脛骨負(fù)荷的合成代謝反應(yīng)，向小鼠尾靜脈注射EB染料來(lái)評(píng)估 WT 和 cKO 小鼠的原位半通道活性。結(jié)果表明，機(jī)械負(fù)荷增加了WT小鼠骨細(xì)胞的EB攝取，但在cKO小鼠中沒(méi)有（圖3 a）。EB熒光強(qiáng)度的定量證實(shí)了cKO小鼠對(duì)EB染料攝取的抑制作用（圖3 b、c）。同樣，機(jī)械負(fù)荷也增加了干骺端小梁骨中EB染料的攝取，但這種增加在cKO小鼠中受到抑制（圖3 d-f）。這些結(jié)果表明，整合素α5在調(diào)節(jié)骨細(xì)胞半通道響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷的開(kāi)放中起著重要作用，其缺失可抑制骨細(xì)胞機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的半通道開(kāi)放。

鑒于Cx43 半通道釋放的細(xì)胞外 PGE2對(duì)骨骼機(jī)械反應(yīng)至關(guān)重要，因此，在 WT 和 cKO 小鼠的血清和脛骨中檢測(cè)了 PGE2 水平，觀察到僅在WT小鼠脛骨中，負(fù)荷誘導(dǎo)PGE2水平增加，在cKO脛骨中這種增加受到抑制，且血清中WT小鼠的PGE2水平也高于cKO小鼠。此外，還確定了整合素α5 在負(fù)荷誘導(dǎo)的硬骨素（SOST）抑制中的參與，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠的對(duì)側(cè)對(duì)照相比，機(jī)械負(fù)荷減少了SOST-陽(yáng)性骨細(xì)胞，但在cKO小鼠的負(fù)荷脛骨中沒(méi)有發(fā)生。

由于骨細(xì)胞中SOST的下調(diào)對(duì)于負(fù)荷誘導(dǎo)的WNT通路激活至關(guān)重要，因此確定了另一種 WNT 信號(hào)分子 β-catenin 在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠對(duì)側(cè)對(duì)照脛骨相比，機(jī)械負(fù)荷導(dǎo)致骨內(nèi)膜表面β-catenin陽(yáng)性成骨細(xì)胞的表達(dá)顯著增加，但在cKO小鼠中沒(méi)有。這些結(jié)果表明，在機(jī)械負(fù)荷過(guò)程中，骨細(xì)胞中整合素α5的缺失阻礙了PGE2的釋放，進(jìn)而降低了骨細(xì)胞中SOST，這與骨內(nèi)膜表面β-catenin表達(dá)和成骨細(xì)胞活性受阻有關(guān)。

圖3    在整合素α5 cKO小鼠中，機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)的骨細(xì)胞半通道開(kāi)放受到抑制。

圖4   骨細(xì)胞整合素a5β1 在骨骼機(jī)械刺激的合成代謝反應(yīng)中的作用圖解。在機(jī)械負(fù)荷下，COX-2 和 PGE2 水平增加。如前所述，在骨細(xì)胞表面表達(dá)的整合素α5β1 將被激活以改變其延伸的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并觸發(fā) Cx43 半通道的開(kāi)放。開(kāi)放的半通道將釋放以自分泌方式發(fā)揮作用的 PGE2通過(guò)EP4受體降低SOST表達(dá)。結(jié)果，成骨細(xì)胞中 β-catenin的表達(dá)增加，導(dǎo)致成骨細(xì)胞活性和骨內(nèi)膜骨形成增加。

總之，這項(xiàng)研究揭示了骨細(xì)胞整合素α5 在骨內(nèi)膜骨表面機(jī)械負(fù)荷的合成代謝反應(yīng)中新的生理作用。該研究表明，整合素α5 和 Cx43 半通道在介導(dǎo)骨骼合成代謝對(duì)機(jī)械負(fù)荷的反應(yīng)方面存在重要關(guān)系，并進(jìn)一步表明整合素α5 可以作為骨骼疾病的新潛在治療靶點(diǎn)。未來(lái)，將開(kāi)展更深入的臨床前研究，以更深入地了解整合素α5 在機(jī)械反應(yīng)中的作用。當(dāng)確定了介導(dǎo)機(jī)械反應(yīng)的關(guān)鍵因子/通路時(shí)，便有望建立潛在的藥物靶點(diǎn)并開(kāi)發(fā)候選藥物，以幫助增強(qiáng)老年患者或身體不便患者的機(jī)械反應(yīng)性和合成代謝功能。

參考文獻(xiàn)：Zhao D, Hua R, Riquelme MA, Cheng H, Guda T, Xu H, Gu S, Jiang JX. Osteocytes regulate bone anabolic response to mechanical loading in male mice via activation of integrin α5. Bone Res. 2022 Jul 18;10(1):49. doi: 10.1038/s41413-022-00222-z. PMID: 35851577; PMCID: PMC9293884.

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