破骨細胞（OCs）是多核巨細胞，在病理刺激的影響下（如核因子κβ配體的受體激活劑RANKL），由單核細胞/巨噬細胞譜系分化而來，有助于骨吸收和重塑。成骨細胞（OB）、OCs、骨細胞和其他骨髓細胞之間精確而有序的分子通訊是調節骨形成和吸收所必需的。破骨細胞介導的骨吸收的主要開關是RANKL，一種由活化OBs釋放的細胞因子。然而，在各種病理條件下，如關節炎、骨質疏松癥和佩吉特骨病，OC介導的骨過度吸收是很明顯的。

骨質破壞的本質是通過與滑膜成纖維細胞和免疫細胞相互作用專門激活了OCs。差異激活的巨噬細胞在各種類型的細胞骨架和其他炎癥相關疾病的病理生理學中起關鍵作用，一般來說，M1和M2骨髓細胞分別參與引發和消退炎癥。因此，調節巨噬細胞極性的細胞治療策略可能通過影響骨質疏松癥和類風濕性關節炎等疾病中不受控制的破骨細胞分化來提供顯著優勢。

骨保護素（OPG）是TNF受體超家族的分泌性糖蛋白，對成骨細胞分化至關重要，由于其在抑制破骨細胞分化中的作用，也被稱為破骨細胞生成抑制因子（OCIF）。OBs通過產生OPG來負調節OC的分化和功能。研究表明，OPG抑制OC分化，并通過隔離RANKL充當誘餌受體，可阻斷 RANK 信號并抑制骨吸收。

牙髓來源的干細胞（DPSCs）是自牙髓中分離的一種間充質干細胞，具有自我更新、多向分化能力，并具有促進血管生成和骨組織修復潛力。此外，DPSCs還被證明具有免疫抑制作用，提示人類DPSCs可用于炎癥和自身免疫性疾病，DPSCs分泌多種生長因子和細胞因子，這些因子對各種細胞具有旁分泌活性，以實現其功能和分化。

基于此，美國德克薩斯理工大學健康科學中心的一項研究曾重點闡明了單核細胞/巨噬細胞樣細胞系 DPSCs對單核細胞/巨噬細胞樣細胞系 RAW 264.7 細胞分化為OCs發揮抑制作用的潛在機制。相關內容發表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 期刊題為“Dental pulp–derived stem cells inhibit osteoclast differentiation by secreting osteoprotegerin and deactivating AKT signalling in myeloid cells"。

首先，為了研究DPSCs對破骨細胞分化的影響，在有或沒有DPSCs 狀態下在無接觸共培養系統中培養破骨細胞前體細胞（RAW 264.7），同時，細胞培養基補充巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和sRANKL以誘導其向破骨細胞方向分化。TRAP染色顯示，在用M-CSF和sRANKL刺激的細胞培養板中觀察到多核破骨細胞，而沒有M-CSF和sRANKL培養的對照RAW 264.7細胞中沒有顯示任何多核TRAP陽性細胞。然而，在DPSCs存在時，同一時間點的多核TRAP陽性細胞的豐度明顯降低。當DPSC：RAW 264.7細胞比例為1:10時，觀察到破骨細胞豐度的劑量依賴性減少，其抑制作用比細胞比例為1：100時更有效。與沒有DPSCs的RAW 264.7細胞相比，在無接觸共培養條件下，在DPSCs存在下分化的RAW 264.7細胞中TRAP陽性的多核細胞數量明顯減少。這些觀察表明，DPSCs能夠抑制破骨細胞分化。

然后，進一步驗證了DPSCs對破骨細胞分化的影響，在存在或不存在無接觸DPSCs共培養的情況下，評估了RAW 264.7細胞在誘導分化6天后各種破骨細胞相關標記基因的mRNA表達。定量PCR分析顯示，分化后的破骨細胞相關基因，如Nfatc1、組織蛋白酶K（Ctsk）、Rank、Trap和MMP9等關鍵基因顯著上調。這些結果證實了RAW 264.7細胞成功分化為OCs。然而，在DPSCs存在下，破骨細胞相關標記基因（如Nfatc1、Ctsk、Rank、Trap和Mmp9）的mRNA表達以劑量依賴性方式顯著降低。

為了確認基因表達向蛋白質的翻譯，在分化6天后，對分離的總蛋白質進行了蛋白質印跡分析。與未分化細胞相比，破骨細胞分化細胞中NFATc1、Ctsk、MMP9和p65的蛋白質水平顯著升高，然而，當在DPSC以劑量依賴性方式存在誘導分化時，蛋白質水平明顯降低。此外，與對照RAW 264.7細胞相比，分化細胞中的NFATc1、Ctsk、MMP9和TRAP陽性多核OCs顯著增加（圖1 A、B），而在DPSCs存在下觀察到分化相關蛋白的數量顯著減少（圖1 A、B）。

圖1    DPSCs抑制RAW 264.7細胞中的破骨細胞分化相關分子。

DPSCs具有免疫調節作用，并可能進一步調節破骨細胞分化過程。因此，接下來測試了DPSCs在RAW 264.7細胞中是否有任何免疫調節作用，在存在或不存在DPSCs的情況下對RAW 264.7細胞進行了無接觸共培養。與對照組相比，在DPSCs存在下，炎癥基因之一TNF-α的表達顯著下調（圖2 A），相反，IL-4Rα，一種抗炎基因的mRNA表達上調（圖2 A）。此外，作為RAW 264.7細胞M2表型特征的精氨酸酶1（Arg1），Ym1（Chil3）顯著增加（圖2 B）。這些數據表明，DPSCs可能具有將巨噬細胞極化為抗炎表型的能力，從而負向調節破骨細胞的分化。

為了進一步了解DPSCs調節骨髓細胞分化的機制，在無接觸共培養條件下在存在或不存在DPSCs的情況下，還評估了RAW 264.7細胞在誘導分化6天后破骨細胞抑制因子骨保護素（OPG）的基因和蛋白質表達。定量PCR分析顯示，誘導破骨細胞分化6 天后，RAW 264.7細胞OPG mRNA顯著降低。然而，在DPSCs存在下誘導RAW 264.7細胞分化為OCs時，OPG的mRNA表達以劑量依賴性方式顯著增加。然后，使用Transwell共培養系統確定了哪些細胞在OCs分化過程中分泌OPG，發現從對照 RAW 264.7 細胞或分化 OCs 收集的上清液中沒有可檢測到的 OPG 范圍。然而，在整個分化過程中，在DPSCs存在下，培養上清液中的OPG水平顯著升高。這些結果表明，RAW 264.7細胞可能沒有分泌OPGs。

圖2   DPSCs抑制促炎基因和誘導M2表型分子抗炎基因的表達。

進一步地，為了確定DPSC是否可以表達和分泌組成型DPSCs，在不同的培養條件下培養DPSCs，在血清饑餓條件下（含1% FBS的DMEM），在培養48和72小時后收集上清液。OPG的mRNA表達顯示，與用含10% FBS的培養基培養的DPSCs相比，血清饑餓在兩個時間點均顯著誘導DPSCs中的OPG表達。然后測量了上清液中分泌的OPG量，發現血清饑餓后OPG水平顯著升高。進一步研究的證實了DPSC在含10% FBS和在受損環境下的培養基中均分泌了OPG。這些觀察表明，DPSCs可以在脅迫條件下分泌組成型OPG，培養基對OPG分泌沒有顯著影響。

為了研究OPG對破骨細胞分化相關分子的影響，在存在或不存在不同濃度的重組OPG的情況下誘導了RAW 264.7細胞的破骨細胞分化，并進行了實時RT-PCR和蛋白質印跡分析。分析顯示，在破骨細胞分化6天后，在OPG存在下，關鍵的破骨細胞相關基因（如Nfatc1、Ctsk、Rank、Trap和Mmp9）顯著降低（圖3 A）。此外，與分化的OCs相比，存在OPG時，關鍵破骨細胞相關蛋白NFATc1、Ctsk 和MMP9水平降低（圖3 B）。這些觀察結果支持OPG抑制破骨細胞分化相關標志物分子的能力。

圖3    重組OPG以劑量依賴性方式抑制破骨細胞分化相關分子。

最后，為了確定DPSC介導的抑制骨髓細胞破骨細胞分化的分子機制，在存在或不存在各種濃度的重組OPG或PI3K抑制劑或DPSCs的情況下誘導RAW 264.7細胞分化。首先，較高濃度（50 ng/mL和100 ng/mL）的OPG顯著抑制了OCs的分化，而較低濃度（5 ng/mL和25 ng/mL）的OPG對抑制破骨細胞分化的作用不大（圖4 A、B）。

蛋白質印跡分析顯示，活化的AKT（磷酸化AKT）在OCs中上調，而OPG的添加以濃度依賴性方式抑制AKT的活化（圖4 C）。在無接觸共培養中存在DPSCs的情況下，也觀察到AKT活化（磷酸化）的抑制（圖4 D）。這些數據表明，DPSC介導的破骨細胞分化抑制模仿了OPG介導的破骨細胞分化抑制的信號級聯反應。通過使用PI3K特異性抑制劑進一步證實了PI3K-AKT通路在破骨細胞分化過程中的參與，發現PI3K抑制劑以劑量依賴性方式顯著降低了破骨細胞分化（圖4 E、F）。

為了確定DPSC是否通過OPG抑制RAW 264.7細胞的破骨細胞分化，實驗在Transwell培養系統中在存在或不存在DPSC或DPSC加抗OPG Ab的情況下誘導破骨細胞分化。TRAP染色顯示，DPSC的存在降低了破骨細胞分化，并且在培養物中加入抗OPG Ab以及DPSC以劑量依賴性方式顯著恢復了破骨細胞分化。這些結果證實了OPG介導的對破骨細胞分化的抑制部分通過DPSC。

圖4     DPSC模仿OPG介導的信號通路（PI3K）來抑制破骨細胞分化。

總之，該研究表明，人類DPSCs通過組成性分泌OPG，降低RAW 264.7細胞中關鍵OC標志物（如NFATc1、Ctsk、TRAP、RANK和MMP-9）的表達來抑制破骨細胞的發生。OPG可能會阻斷RANK-RANKL相互作用，這對于OCs的分化至關重要。此外，DPSCs降低了RAW 264.7細胞的炎癥信號，并將RAW 264.7細胞極化為M2表型，從而抑制破骨細胞分化。研究進一步證實，在OC分化過程中，OPG介導的PI3K信號通路（AKT）激活的抑制趨勢與DPSC介導的OC分化抑制相似。使用抗OPG抗體的挽救實驗部分證實了OPG介導的DPSCs抑制OC分化的可能性。這項研究提供了DPSC介導的破骨形成機制抑制的證據。

參考文獻：Kanji S, Sarkar R, Pramanik A, Kshirsagar S, Greene CJ, Das H. Dental pulp-derived stem cells inhibit osteoclast differentiation by secreting osteoprotegerin and deactivating AKT signalling in myeloid cells. J Cell Mol Med. 2021 Mar;25(5):2390-2403. doi: 10.1111/jcmm.16071. Epub 2021 Jan 28. PMID: 33511706; PMCID: PMC7933945.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33511706/

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