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剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的circ_1199在EPCs間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制

時(shí)間:2023/4/3閱讀:163

研究表明,內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndoMT)參與病理性血管重塑過(guò)程。作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)EndoMT也是病理性血管重塑的常見(jiàn)機(jī)制。此外,振蕩剪切應(yīng)力(OSS)促進(jìn)了EPC EndoMT。EPCs暴露于OSS后,內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達(dá)下調(diào)。同時(shí),間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)顯著增加。因此,濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、淄博市中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心的一項(xiàng)研究探討了OSS誘導(dǎo)的EPC EndoMT的機(jī)制,以期進(jìn)一步闡明OSS對(duì)EPC EndoMT的影響以及病理性血管重塑的發(fā)生和發(fā)展。


外泌體(Exos)是具有完整膜結(jié)構(gòu)(直徑30-150nm)的納米級(jí)細(xì)胞外囊泡,主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞。Exos被認(rèn)為是細(xì)胞-細(xì)胞通訊的重要介質(zhì),參與許多生理和病理過(guò)程。在這項(xiàng)研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)OSS處理的EPCs釋放的Exos(OSS-Exos)可以誘導(dǎo)EPC EndoMT。但內(nèi)部機(jī)制有待進(jìn)一步探討。


最近,Exos中的環(huán)形RNAs(circRNAs)引起了廣泛的關(guān)注。CircRNAs具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。新出現(xiàn)的證據(jù)表明,外泌體circRNAs在復(fù)雜的人類病理學(xué)中起著重要作用。此外,circRNAs可以充當(dāng)miRNA分子的“海綿",抑制miRNA與靶基因mRNAs的結(jié)合,從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。


該團(tuán)隊(duì)使用高通量測(cè)序技術(shù)研究了暴露于OSS的EPCs中circRNAs的表達(dá)譜。基于生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)circ-1199被OSS顯著上調(diào)并明顯加載到Exos中。然而,OSS誘導(dǎo)的EPC EndoMT是否由外泌體circ-1199介導(dǎo)目前尚不清楚。該研究旨在探討 Exos  和外泌體circ-1199對(duì)EPC EndoMT的影響和可能機(jī)制。



從 OSS 處理的 EPCs 灌流液中分離的Exos誘導(dǎo) EPC EndoMT 


EPCs分泌的Exos影響血管細(xì)胞和組織功能,實(shí)驗(yàn)首先確定了Exos是否參與OSS(±3.5 dyne/cm2,1 Hz)誘導(dǎo)的EPC EndoMT。從細(xì)胞上清液(Static-Exos)或灌流液(OSS-Exos)中分離Exos。WB揭示了EPCs衍生的Exos表達(dá)CD9、CD81和CD63,它們是Exos的代表標(biāo)志物。


為了評(píng)估OSS-Exos對(duì)EPC的影響,PKH26標(biāo)記的Exos與EPCs的共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)這些Exos被EPCs有效地吸收(圖1 D)。EdU測(cè)定結(jié)果表明,OSS-Exos顯著增加了EPCs的增殖(圖1 E)。RT-qPCR和WB結(jié)果顯示,OSS-Exos下調(diào)內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和VE-鈣粘蛋白的表達(dá),上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)(圖1 F、G)。這些數(shù)據(jù)表明,OSS-Exos在EPCs中誘導(dǎo)了EndoMT。



圖1    OSS-Exos誘導(dǎo)EPC增殖和EndoMT。



Circ-1199 在用 OSS 和 OSS-Exos 處理的 EPCs 中顯著上調(diào)


通過(guò)高通量RNA測(cè)序篩選用OSS處理的EPCs中表達(dá)的circRNAs。如圖2 A-B所示,基于生物信息學(xué)分析,選擇circ-1199作為靶向circRNA。接下來(lái),通過(guò)RT-qPCR證實(shí)了circ-1199在OSS 加載的EPCs中的表達(dá)。結(jié)果表明,當(dāng)EPCs加載OSS持續(xù) 3、6、12、24 h時(shí),circ-1199在6 h后增加,并在24 h內(nèi)保持較高水平(圖2 C)。此外,RNA FISH表明EPCs在靜態(tài)狀態(tài)下很少表達(dá)circ-1199,但在OSS加載后circ-1199陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加(圖2 D)。


接下來(lái),進(jìn)行RT-qPCR和RNA FISH測(cè)定以測(cè)量Exos中circ-1199的表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果顯示,OSS-Exos中circ-1199的水平高于靜態(tài)-Exos(圖2 E)。RNA FISH結(jié)果表明,當(dāng)Exos與EPCs共培養(yǎng)時(shí),OSS-Exos處理的EPCs中circ-1199的表達(dá)高于靜態(tài)-Exos處理的EPCs(圖2 F)。



圖2   Circ-1199在用OSS處理的EPC中異常表達(dá)。



Circ-1199 促進(jìn)了 EPC EndoMT


為了評(píng)估circ-1199對(duì)EPC EndoMT的影響,將circ-1199過(guò)表達(dá)慢病毒載體(LV-circ-1199)轉(zhuǎn)染到EPCs中。結(jié)果表明,用LV-circ-1199轉(zhuǎn)染EPCs后,circ-1199的表達(dá)明顯上調(diào),增殖明顯增加。此外,內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達(dá)降低,而間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)在基因和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)。這些結(jié)果與用OSS-Exos處理的EPCs的結(jié)果一致。



Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA 參與 EPC EndoMT


新興研究表明,circRNAs的主要機(jī)制是作為miRNA的海綿,從而釋放miRNAs對(duì)靶基因的抑制作用。然后,實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)了miRNAs和circRNAs之間的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明,circ-1199具有兩種類型的miRNAs(miR-520f和let-7g-5p)的結(jié)合位點(diǎn),let-7g-5p表現(xiàn)出更多的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí),獲得了94個(gè)靶基因作為let-7g-5p候選基因,其中HMGA2得分最高。雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示,circ-1199有效結(jié)合let-7g-5p(圖3 C),let-7g-5p也與HMGA2 mRNA的3′UTR結(jié)合(圖3 D)。RT-qPCR結(jié)果表明,circ-1199的過(guò)表達(dá)降低了let-7g-5p的表達(dá),同時(shí)增加了HMGA2的表達(dá)(圖3 E)。此外,let-7g-5p模擬物(圖3 F)和LV-shHMGA2(圖3 G)都下調(diào)了EPCs中α-SMA和SM22α的表達(dá)。


有趣的是,用OSS-Exos處理EPCs后,circ-1199的表達(dá)增加(圖3 H)。同時(shí),let-7g-5p的表達(dá)降低(圖3 I),HMGA2顯著增加(圖3 J)。WB結(jié)果證實(shí)了HMGA2的上調(diào)表達(dá)(圖3 K)。


這些結(jié)果表明,OSS-Exos可以上調(diào)circ-1199,從而可能發(fā)揮分子“海綿"的作用吸附let-7g-5p,從而增加HMGA2的表達(dá)。



圖3   Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA參與EPC EndoMT。



Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 調(diào)節(jié) EPC 轉(zhuǎn)錄因子 Smad3 和 Snail


據(jù)報(bào)道,多種信號(hào)通路,如TGF-β/Smad信號(hào)、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)和Notch信號(hào)通路,都參與了EndoMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明,HMGA2上調(diào)TGF-β/Smad信號(hào)通路中Snail、Twist 和Slug 的表達(dá),從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞中上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化(EMT)。因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)錄因子Smad3和Snail是否參與EPCs的EndoMT過(guò)程。WB結(jié)果表明,OSS-Exos處理EPCs后,p-Smad3/Smad3和Snail的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。


為了進(jìn)一步了解OSS-Exos激活EPCs中EndoMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的機(jī)制,在用LV-circ-1199,let-7g-5p模擬物或LV-shHMGA2預(yù)處理EPCs后測(cè)量了HMGA2,p-Smad3 / Smad3和Snail的表達(dá)。結(jié)果表明,經(jīng)LV-circ-1199、let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2處理后,HMGA2、p-Smad3/Smad3和Snail 的表達(dá)均上調(diào)。然而,let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2抑制了EPCs中HMGA2,p-Smad3/Smad3和Snail的表達(dá)。


這些結(jié)果表明,circ-1199–let-7g-5p–HMGA2參與了EPCs中OSS-Exos誘導(dǎo)的p-Smad3/Smad3和 Snail 的激活。



OSS-Exos 和 circ-1199 在體外和體內(nèi)都損傷了 EPCs 的血管生成


血管生成能力是EPCs的重要功能。血管生成能力下降是 EPC s中 EndoMT 之后的標(biāo)志性事件。為了進(jìn)一步研究OSS-Exos對(duì)EPC功能的影響,實(shí)驗(yàn)在體外評(píng)估了血管生成。結(jié)果表明,OSS-Exos組EPC血管生成顯著降低(圖4 A)。此外,用LV-circ-1199轉(zhuǎn)染后,EPCs的血管生成能力也明顯降低(圖4 B)。


接下來(lái),使用Matrigel plug 測(cè)定法來(lái)測(cè)定小鼠體內(nèi)EPCs的血管生成。結(jié)果表明,用OSS-Exos處理的EPCs形成較少的血管樣結(jié)構(gòu)(圖4 C)。此外,在OSS-Exos處理的EPCs中,CD31和vWF的表達(dá)降低(圖4 D),α-SMA和SM22α的表達(dá)增加(圖4 E)。


此外,與對(duì)照組相比,用LV-circ-1199處理EPCs后,血管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量減少(圖4 F)。同時(shí),內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和vWF的表達(dá)降低(圖4 G),但間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)明顯增加(圖4 H)。



圖4   OSS-Exos和circ-1199在體外和體內(nèi)都損害了EPCs的血管生成。



圖5  在Exos circ-1199處理后 EPC EndoMT的機(jī)制。


綜上所述,在OSS-Exos中富集的circ-1199促進(jìn)EPC EndoMT并作為let-7g-5p的分子海綿,從而上調(diào)HMGA2的表達(dá)。然后p-Smad3/Smad3/Snail 可能參與這個(gè)過(guò)程(圖5)。




參考文獻(xiàn):Li L, Wen J, Li H, He Y, Cui X, Zhang X, Guan X, Li Z, Cheng M. Exosomal circ-1199 derived from EPCs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of EPCs by increasing HMGA2 expression. Life Sci. 2023 Jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. Epub 2022 Nov 23. PMID: 36435223.

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