研究表明，內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndoMT）參與病理性血管重塑過程。作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）EndoMT也是病理性血管重塑的常見機(jī)制。此外，振蕩剪切應(yīng)力（OSS）促進(jìn)了EPC EndoMT。EPCs暴露于OSS后，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)顯著增加。因此，濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、淄博市中心醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心的一項(xiàng)研究探討了OSS誘導(dǎo)的EPC EndoMT的機(jī)制，以期進(jìn)一步闡明OSS對EPC EndoMT的影響以及病理性血管重塑的發(fā)生和發(fā)展。

外泌體（Exos）是具有完整膜結(jié)構(gòu)（直徑30-150nm）的納米級細(xì)胞外囊泡，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞。Exos被認(rèn)為是細(xì)胞-細(xì)胞通訊的重要介質(zhì)，參與許多生理和病理過程。在這項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)OSS處理的EPCs釋放的Exos（OSS-Exos）可以誘導(dǎo)EPC EndoMT。但內(nèi)部機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

最近，Exos中的環(huán)形RNAs（circRNAs）引起了廣泛的關(guān)注。CircRNAs具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，外泌體circRNAs在復(fù)雜的人類病理學(xué)中起著重要作用。此外，circRNAs可以充當(dāng)miRNA分子的“海綿"，抑制miRNA與靶基因mRNAs的結(jié)合，從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

該團(tuán)隊(duì)使用高通量測序技術(shù)研究了暴露于OSS的EPCs中circRNAs的表達(dá)譜。基于生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circ-1199被OSS顯著上調(diào)并明顯加載到Exos中。然而，OSS誘導(dǎo)的EPC EndoMT是否由外泌體circ-1199介導(dǎo)目前尚不清楚。該研究旨在探討 Exos  和外泌體circ-1199對EPC EndoMT的影響和可能機(jī)制。

從 OSS 處理的 EPCs 灌流液中分離的Exos誘導(dǎo) EPC EndoMT 

EPCs分泌的Exos影響血管細(xì)胞和組織功能，實(shí)驗(yàn)首先確定了Exos是否參與OSS（±3.5 dyne/cm2，1 Hz）誘導(dǎo)的EPC EndoMT。從細(xì)胞上清液（Static-Exos）或灌流液（OSS-Exos）中分離Exos。WB揭示了EPCs衍生的Exos表達(dá)CD9、CD81和CD63，它們是Exos的代表標(biāo)志物。

為了評估OSS-Exos對EPC的影響，PKH26標(biāo)記的Exos與EPCs的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些Exos被EPCs有效地吸收（圖1 D）。EdU測定結(jié)果表明，OSS-Exos顯著增加了EPCs的增殖（圖1 E）。RT-qPCR和WB結(jié)果顯示，OSS-Exos下調(diào)內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和VE-鈣粘蛋白的表達(dá)，上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)（圖1 F、G）。這些數(shù)據(jù)表明，OSS-Exos在EPCs中誘導(dǎo)了EndoMT。

圖1    OSS-Exos誘導(dǎo)EPC增殖和EndoMT。

Circ-1199 在用 OSS 和 OSS-Exos 處理的 EPCs 中顯著上調(diào)

通過高通量RNA測序篩選用OSS處理的EPCs中表達(dá)的circRNAs。如圖2 A-B所示，基于生物信息學(xué)分析，選擇circ-1199作為靶向circRNA。接下來，通過RT-qPCR證實(shí)了circ-1199在OSS 加載的EPCs中的表達(dá)。結(jié)果表明，當(dāng)EPCs加載OSS持續(xù) 3、6、12、24 h時(shí)，circ-1199在6 h后增加，并在24 h內(nèi)保持較高水平（圖2 C）。此外，RNA FISH表明EPCs在靜態(tài)狀態(tài)下很少表達(dá)circ-1199，但在OSS加載后circ-1199陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加（圖2 D）。

接下來，進(jìn)行RT-qPCR和RNA FISH測定以測量Exos中circ-1199的表達(dá)。RT-qPCR結(jié)果顯示，OSS-Exos中circ-1199的水平高于靜態(tài)-Exos（圖2 E）。RNA FISH結(jié)果表明，當(dāng)Exos與EPCs共培養(yǎng)時(shí)，OSS-Exos處理的EPCs中circ-1199的表達(dá)高于靜態(tài)-Exos處理的EPCs（圖2 F）。

圖2   Circ-1199在用OSS處理的EPC中異常表達(dá)。

Circ-1199 促進(jìn)了 EPC EndoMT

為了評估circ-1199對EPC EndoMT的影響，將circ-1199過表達(dá)慢病毒載體（LV-circ-1199）轉(zhuǎn)染到EPCs中。結(jié)果表明，用LV-circ-1199轉(zhuǎn)染EPCs后，circ-1199的表達(dá)明顯上調(diào)，增殖明顯增加。此外，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達(dá)降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)在基因和蛋白質(zhì)水平均上調(diào)。這些結(jié)果與用OSS-Exos處理的EPCs的結(jié)果一致。

Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA 參與 EPC EndoMT

新興研究表明，circRNAs的主要機(jī)制是作為miRNA的海綿，從而釋放miRNAs對靶基因的抑制作用。然后，實(shí)驗(yàn)預(yù)測了miRNAs和circRNAs之間的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，circ-1199具有兩種類型的miRNAs（miR-520f和let-7g-5p）的結(jié)合位點(diǎn)，let-7g-5p表現(xiàn)出更多的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)，獲得了94個(gè)靶基因作為let-7g-5p候選基因，其中HMGA2得分最高。雙熒光素酶報(bào)告基因測定顯示，circ-1199有效結(jié)合let-7g-5p（圖3 C），let-7g-5p也與HMGA2 mRNA的3′UTR結(jié)合（圖3 D）。RT-qPCR結(jié)果表明，circ-1199的過表達(dá)降低了let-7g-5p的表達(dá)，同時(shí)增加了HMGA2的表達(dá)（圖3 E）。此外，let-7g-5p模擬物（圖3 F）和LV-shHMGA2（圖3 G）都下調(diào)了EPCs中α-SMA和SM22α的表達(dá)。

有趣的是，用OSS-Exos處理EPCs后，circ-1199的表達(dá)增加（圖3 H）。同時(shí)，let-7g-5p的表達(dá)降低（圖3 I），HMGA2顯著增加（圖3 J）。WB結(jié)果證實(shí)了HMGA2的上調(diào)表達(dá)（圖3 K）。

這些結(jié)果表明，OSS-Exos可以上調(diào)circ-1199，從而可能發(fā)揮分子“海綿"的作用吸附let-7g-5p，從而增加HMGA2的表達(dá)。

圖3   Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA參與EPC EndoMT。

Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 調(diào)節(jié) EPC 轉(zhuǎn)錄因子 Smad3 和 Snail

據(jù)報(bào)道，多種信號通路，如TGF-β/Smad信號、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號和Notch信號通路，都參與了EndoMT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，HMGA2上調(diào)TGF-β/Smad信號通路中Snail、Twist 和Slug 的表達(dá)，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞中上皮到間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化（EMT）。因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)錄因子Smad3和Snail是否參與EPCs的EndoMT過程。WB結(jié)果表明，OSS-Exos處理EPCs后，p-Smad3/Smad3和Snail的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。

為了進(jìn)一步了解OSS-Exos激活EPCs中EndoMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的機(jī)制，在用LV-circ-1199，let-7g-5p模擬物或LV-shHMGA2預(yù)處理EPCs后測量了HMGA2，p-Smad3 / Smad3和Snail的表達(dá)。結(jié)果表明，經(jīng)LV-circ-1199、let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2處理后，HMGA2、p-Smad3/Smad3和Snail 的表達(dá)均上調(diào)。然而，let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2抑制了EPCs中HMGA2，p-Smad3/Smad3和Snail的表達(dá)。

這些結(jié)果表明，circ-1199–let-7g-5p–HMGA2參與了EPCs中OSS-Exos誘導(dǎo)的p-Smad3/Smad3和 Snail 的激活。

OSS-Exos 和 circ-1199 在體外和體內(nèi)都損傷了 EPCs 的血管生成

血管生成能力是EPCs的重要功能。血管生成能力下降是 EPC s中 EndoMT 之后的標(biāo)志性事件。為了進(jìn)一步研究OSS-Exos對EPC功能的影響，實(shí)驗(yàn)在體外評估了血管生成。結(jié)果表明，OSS-Exos組EPC血管生成顯著降低（圖4 A）。此外，用LV-circ-1199轉(zhuǎn)染后，EPCs的血管生成能力也明顯降低（圖4 B）。

接下來，使用Matrigel plug 測定法來測定小鼠體內(nèi)EPCs的血管生成。結(jié)果表明，用OSS-Exos處理的EPCs形成較少的血管樣結(jié)構(gòu)（圖4 C）。此外，在OSS-Exos處理的EPCs中，CD31和vWF的表達(dá)降低（圖4 D），α-SMA和SM22α的表達(dá)增加（圖4 E）。

此外，與對照組相比，用LV-circ-1199處理EPCs后，血管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量減少（圖4 F）。同時(shí)，內(nèi)皮標(biāo)志物CD31和vWF的表達(dá)降低（圖4 G），但間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA和SM22α的表達(dá)明顯增加（圖4 H）。

圖4   OSS-Exos和circ-1199在體外和體內(nèi)都損害了EPCs的血管生成。

圖5  在Exos circ-1199處理后 EPC EndoMT的機(jī)制。

綜上所述，在OSS-Exos中富集的circ-1199促進(jìn)EPC EndoMT并作為let-7g-5p的分子海綿，從而上調(diào)HMGA2的表達(dá)。然后p-Smad3/Smad3/Snail 可能參與這個(gè)過程（圖5）。

參考文獻(xiàn)：Li L, Wen J, Li H, He Y, Cui X, Zhang X, Guan X, Li Z, Cheng M. Exosomal circ-1199 derived from EPCs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of EPCs by increasing HMGA2 expression. Life Sci. 2023 Jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. Epub 2022 Nov 23. PMID: 36435223.