研究表明,內皮-間充質轉化(EndoMT)參與病理性血管重塑過程。作為內皮細胞的前體細胞,內皮祖細胞(EPCs)EndoMT也是病理性血管重塑的常見機制。此外,振蕩剪切應力(OSS)促進了EPC EndoMT。EPCs暴露于OSS后,內皮細胞標志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達下調。同時,間充質細胞標志物α-SMA和SM22α的表達顯著增加。因此,濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學院、淄博市中心醫(yī)院轉化醫(yī)學中心的一項研究探討了OSS誘導的EPC EndoMT的機制,以期進一步闡明OSS對EPC EndoMT的影響以及病理性血管重塑的發(fā)生和發(fā)展。
外泌體(Exos)是具有完整膜結構(直徑30-150nm)的納米級細胞外囊泡,主要負責細胞間的物質運輸和信息傳遞。Exos被認為是細胞-細胞通訊的重要介質,參與許多生理和病理過程。在這項研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)OSS處理的EPCs釋放的Exos(OSS-Exos)可以誘導EPC EndoMT。但內部機制有待進一步探討。
最近,Exos中的環(huán)形RNAs(circRNAs)引起了廣泛的關注。CircRNAs具有共價閉環(huán)結構。新出現(xiàn)的證據(jù)表明,外泌體circRNAs在復雜的人類病理學中起著重要作用。此外,circRNAs可以充當miRNA分子的“海綿",抑制miRNA與靶基因mRNAs的結合,從而促進靶基因的轉錄。
該團隊使用高通量測序技術研究了暴露于OSS的EPCs中circRNAs的表達譜。基于生物信息學分析和實驗驗證,發(fā)現(xiàn)circ-1199被OSS顯著上調并明顯加載到Exos中。然而,OSS誘導的EPC EndoMT是否由外泌體circ-1199介導目前尚不清楚。該研究旨在探討 Exos 和外泌體circ-1199對EPC EndoMT的影響和可能機制。
從 OSS 處理的 EPCs 灌流液中分離的Exos誘導 EPC EndoMT
EPCs分泌的Exos影響血管細胞和組織功能,實驗首先確定了Exos是否參與OSS(±3.5 dyne/cm2,1 Hz)誘導的EPC EndoMT。從細胞上清液(Static-Exos)或灌流液(OSS-Exos)中分離Exos。WB揭示了EPCs衍生的Exos表達CD9、CD81和CD63,它們是Exos的代表標志物。
為了評估OSS-Exos對EPC的影響,PKH26標記的Exos與EPCs的共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)這些Exos被EPCs有效地吸收(圖1 D)。EdU測定結果表明,OSS-Exos顯著增加了EPCs的增殖(圖1 E)。RT-qPCR和WB結果顯示,OSS-Exos下調內皮標志物CD31和VE-鈣粘蛋白的表達,上調間充質細胞標志物α-SMA和SM22α的表達(圖1 F、G)。這些數(shù)據(jù)表明,OSS-Exos在EPCs中誘導了EndoMT。
圖1 OSS-Exos誘導EPC增殖和EndoMT。
Circ-1199 在用 OSS 和 OSS-Exos 處理的 EPCs 中顯著上調
通過高通量RNA測序篩選用OSS處理的EPCs中表達的circRNAs。如圖2 A-B所示,基于生物信息學分析,選擇circ-1199作為靶向circRNA。接下來,通過RT-qPCR證實了circ-1199在OSS 加載的EPCs中的表達。結果表明,當EPCs加載OSS持續(xù) 3、6、12、24 h時,circ-1199在6 h后增加,并在24 h內保持較高水平(圖2 C)。此外,RNA FISH表明EPCs在靜態(tài)狀態(tài)下很少表達circ-1199,但在OSS加載后circ-1199陽性細胞數(shù)量明顯增加(圖2 D)。
接下來,進行RT-qPCR和RNA FISH測定以測量Exos中circ-1199的表達。RT-qPCR結果顯示,OSS-Exos中circ-1199的水平高于靜態(tài)-Exos(圖2 E)。RNA FISH結果表明,當Exos與EPCs共培養(yǎng)時,OSS-Exos處理的EPCs中circ-1199的表達高于靜態(tài)-Exos處理的EPCs(圖2 F)。
圖2 Circ-1199在用OSS處理的EPC中異常表達。
Circ-1199 促進了 EPC EndoMT
為了評估circ-1199對EPC EndoMT的影響,將circ-1199過表達慢病毒載體(LV-circ-1199)轉染到EPCs中。結果表明,用LV-circ-1199轉染EPCs后,circ-1199的表達明顯上調,增殖明顯增加。此外,內皮細胞標志物VE-鈣粘蛋白和CD31的表達降低,而間充質標志物α-SMA和SM22α的表達在基因和蛋白質水平均上調。這些結果與用OSS-Exos處理的EPCs的結果一致。
Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA 參與 EPC EndoMT
新興研究表明,circRNAs的主要機制是作為miRNA的海綿,從而釋放miRNAs對靶基因的抑制作用。然后,實驗預測了miRNAs和circRNAs之間的結合位點。結果表明,circ-1199具有兩種類型的miRNAs(miR-520f和let-7g-5p)的結合位點,let-7g-5p表現(xiàn)出更多的結合位點。同時,獲得了94個靶基因作為let-7g-5p候選基因,其中HMGA2得分最高。雙熒光素酶報告基因測定顯示,circ-1199有效結合let-7g-5p(圖3 C),let-7g-5p也與HMGA2 mRNA的3′UTR結合(圖3 D)。RT-qPCR結果表明,circ-1199的過表達降低了let-7g-5p的表達,同時增加了HMGA2的表達(圖3 E)。此外,let-7g-5p模擬物(圖3 F)和LV-shHMGA2(圖3 G)都下調了EPCs中α-SMA和SM22α的表達。
有趣的是,用OSS-Exos處理EPCs后,circ-1199的表達增加(圖3 H)。同時,let-7g-5p的表達降低(圖3 I),HMGA2顯著增加(圖3 J)。WB結果證實了HMGA2的上調表達(圖3 K)。
這些結果表明,OSS-Exos可以上調circ-1199,從而可能發(fā)揮分子“海綿"的作用吸附let-7g-5p,從而增加HMGA2的表達。
圖3 Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 ceRNA參與EPC EndoMT。
Circ-1199–let-7g-5p–HMGA2 調節(jié) EPC 轉錄因子 Smad3 和 Snail
據(jù)報道,多種信號通路,如TGF-β/Smad信號、Wnt/β-連環(huán)蛋白信號和Notch信號通路,都參與了EndoMT的轉錄調控。研究表明,HMGA2上調TGF-β/Smad信號通路中Snail、Twist 和Slug 的表達,從而導致上皮細胞中上皮到間充質的轉化(EMT)。因此,實驗進一步研究了轉錄因子Smad3和Snail是否參與EPCs的EndoMT過程。WB結果表明,OSS-Exos處理EPCs后,p-Smad3/Smad3和Snail的蛋白表達明顯上調。
為了進一步了解OSS-Exos激活EPCs中EndoMT相關轉錄因子的機制,在用LV-circ-1199,let-7g-5p模擬物或LV-shHMGA2預處理EPCs后測量了HMGA2,p-Smad3 / Smad3和Snail的表達。結果表明,經LV-circ-1199、let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2處理后,HMGA2、p-Smad3/Smad3和Snail 的表達均上調。然而,let-7g-5p模擬物和LV-shHMGA2抑制了EPCs中HMGA2,p-Smad3/Smad3和Snail的表達。
這些結果表明,circ-1199–let-7g-5p–HMGA2參與了EPCs中OSS-Exos誘導的p-Smad3/Smad3和 Snail 的激活。
OSS-Exos 和 circ-1199 在體外和體內都損傷了 EPCs 的血管生成
血管生成能力是EPCs的重要功能。血管生成能力下降是 EPC s中 EndoMT 之后的標志性事件。為了進一步研究OSS-Exos對EPC功能的影響,實驗在體外評估了血管生成。結果表明,OSS-Exos組EPC血管生成顯著降低(圖4 A)。此外,用LV-circ-1199轉染后,EPCs的血管生成能力也明顯降低(圖4 B)。
接下來,使用Matrigel plug 測定法來測定小鼠體內EPCs的血管生成。結果表明,用OSS-Exos處理的EPCs形成較少的血管樣結構(圖4 C)。此外,在OSS-Exos處理的EPCs中,CD31和vWF的表達降低(圖4 D),α-SMA和SM22α的表達增加(圖4 E)。
此外,與對照組相比,用LV-circ-1199處理EPCs后,血管狀結構的數(shù)量減少(圖4 F)。同時,內皮標志物CD31和vWF的表達降低(圖4 G),但間充質標志物α-SMA和SM22α的表達明顯增加(圖4 H)。
圖4 OSS-Exos和circ-1199在體外和體內都損害了EPCs的血管生成。
圖5 在Exos circ-1199處理后 EPC EndoMT的機制。
綜上所述,在OSS-Exos中富集的circ-1199促進EPC EndoMT并作為let-7g-5p的分子海綿,從而上調HMGA2的表達。然后p-Smad3/Smad3/Snail 可能參與這個過程(圖5)。
參考文獻:Li L, Wen J, Li H, He Y, Cui X, Zhang X, Guan X, Li Z, Cheng M. Exosomal circ-1199 derived from EPCs exposed to oscillating shear stress acts as a sponge of let-7g-5p to promote endothelial-mesenchymal transition of EPCs by increasing HMGA2 expression. Life Sci. 2023 Jan 1;312:121223. doi: 10.1016/j.lfs.2022.121223. Epub 2022 Nov 23. PMID: 36435223.
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