慢性腎臟?。–KD）導致色氨酸代謝引起的尿毒癥毒素的病理性積累，例如硫酸吲哚酚（IS）、吲哚乙酸（IAA）和犬尿氨酸。這些毒素是轉錄因子芳香烴受體（AHR）的激動劑，并誘導其在不同細胞（尤其是內皮細胞）中的活化。CKD患者AHR激動劑的積累是有害的，色氨酸來源的尿毒癥毒素的許多有害作用與其AHR激活能力有關。

細胞色素P450 CYP1A1和CYP1B1 和AHR阻遏物（AHRR）受AHR基因組通路的調節。雖然AHR可以通過基因組通路直接調控轉錄，但它也可以通過在所謂的非基因組通路中激活信號分子和其他轉錄因子來間接調節基因表達。AHR介導的內皮組織因子（TF）調控就是這種情況，TF是凝血的主要引發因素。除了配體刺激外，AHR還可通過血流動力學力（如流體剪切應力）在內皮細胞中被強烈激活。有研究通過上調 CYP1A1 和 CYP1B1，證明了AHR激活取決于剪切應力的大小和時間平均值。

相比之下，通過誘導促動脈粥樣硬化和血栓形成機制，吲哚類尿毒癥毒素激活的AHR在很大程度上被證明對內皮細胞有害，并與心血管疾病有關。目前尚不清楚由尿毒癥毒素誘導的病理性AHR激活如何影響內皮細胞對剪切應力介導的生理AHR激活的反應。因此，法國艾克斯-馬賽大學、圣穆斯醫院及阿爾及利亞奧蘭大學生物學系的一項研究曾探討了層流剪切應力和吲哚類尿毒癥毒素硫酸吲哚酚對AHR的激活作用，檢查了受 AHR不同調控的基因的表達，重點是TF。

剪切應力和IS對AHR和AHRR表達的影響

首先，實驗研究了AHR及其阻遏物AHRR在人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中的mRNA表達，HUVEC 在5 dynes/cm2 的層流剪切應力和/或 200 μM的AHR激動劑IS暴露4小時和24小時。結果表明，層流剪切應力誘導AHR（圖1 A）和 AHRR （圖1 B）表達的持續增加。相反，IS刺激不影響AHR表達（圖1 C），但增加 AHRR表達，并在4小時達到最大值，然后在24小時降低，但仍保持顯著的高水平（圖1 D）。

然后，使用AHR的小干擾RNA敲低（AHR siRNA）和AHR抑制劑CH223191 研究了AHR在剪切應力介導的AHRR上調中的作用。結果表明，AHR siRNA 和CH223191強烈抑制剪切應力誘導的AHRR上調（圖1 E）。

當在剪切應力條件下用IS刺激內皮細胞時（圖1 F），IS輕微增加了剪切應力誘導的AHRR的mRNA表達（圖1 F）。在剪切應力條件下以及靜態條件下，AHR siRNA對AHR的抑制顯著降低了IS介導的AHRR誘導（圖1 F）。

圖1   剪切應力和硫酸吲哚酚（IS）對芳香烴受體（AHR）和AHR依賴性阻遏物（AHRR）表達的影響。

剪切應力和 IS 對 COX2、CYP1A1 和 CYP1B1 的上調具有 AHR 依賴的加性效應

接下來，實驗研究了暴露于層流剪切應力和IS的HUVEC中AHR靶基因PTGS2（COX2），CYP1A1和CYP1B1的上調。層流剪切應力（圖2 A）和 IS（圖2 B）增加COX2 mRNA表達。在剪切應力條件下，COX2誘導量在4 h時最大，并在24 h時保持維持。IS誘導的COX2上調低于剪切應力誘導的COX2上調，無論何時（圖2 B）。AHR siRNA和CH223191降低剪切應力誘導的COX2上調（圖2 C）。AHR siRNA在靜態條件下抑制IS對COX2的上調（圖2 D）。當內皮細胞在剪切應力下用IS刺激時，IS擴增剪切應力誘導的COX2 mRNA的表達（圖2 D）。在剪切應力和靜態條件下，抑制 AHR顯著降低了IS誘導的COX2上調（圖2 D）。

然后研究了AHR參與CYP1A1和CYP1B1 mRNA的上調，以及剪切應力和IS對CYP1A1和CYP1B1上調的潛在加性效應。抑制 AHR強烈降低了剪切應力和IS誘導的CYP1A1和CYP1B1的上調。當內皮細胞在剪切應力條件下用IS刺激時，IS擴增剪切應力誘導的CYP1A1和 CYP1B1 mRNA的表達，這通過AHR siRNA抑制AHR后顯著降低。

圖2   剪切應力和IS對COX2上調的AHR依賴性加性效應。

染料木素抑制剪切應力和 IS 介導的 AHR 靶基因激活

然后實驗分析了染料木素（Genistein）的作用，這是一種酪氨酸蛋白激酶抑制劑，也可抑制AHR核易位。結果表明，染料木素強烈抑制所有剪切應力誘導的AHR靶基因：AHRR 、PTGS2（COX2）、CYP1A1和CYP1B1。此外，在靜態和剪切應力條件下用IS刺激的HUVEC中，染料木素顯著抑制了AHRR、 COX2、CYP1A1和CYP1B1 mRNA的上調。

剪切應力和 IS 上調的 TF 依賴于 AHR 的激活

接下來，實驗將重點放在TF（由F3基因編碼），并研究了其在暴露于層流剪切應力的HUVEC或用200 μM IS刺激的細胞中的AHR依賴性上調。

層流剪切應力（圖3 A）和 IS 刺激（圖3 B）以時間依賴性方式增加TF的mRNA表達。在剪切應力條件下，TF表達在4 h時增加，24 h時最大。IS誘導的TF上調具有相同的動力學特征，但低于剪切應力誘導的TF上調，與時間無關（圖3 B）。在剪切應力條件下用IS刺激的內皮細胞中，IS擴增剪切應力誘導的TF mRNA表達（圖3 F）。剪切應力和IS刺激也以類似的方式增加了4小時時TF的蛋白表達（圖3 C）。此外，IS擴增剪切應力誘導的TF蛋白表達（圖3 C）。

實驗驗證了AHR不與F3啟動子結合以誘導IS刺激的HUVEC中的TF表達。ChIP 實驗表明 AHR 在 F3 啟動子上沒有富集，表明 IS 刺激不會誘導 AHR 募集到 F3 啟動子（圖3 D）。正如預期的那樣，AHR被募集到已知含有XRE序列的CYP1B1啟動子中，在IS刺激HUVEC后（圖3 D）。

最后分析了抑制AHR在剪切應力和IS誘導的TF中的影響。AHR siRNA 和 AHR 抑制劑CH223191顯著抑制剪切應力誘導的TF表達（圖3 E）。此外，在靜態和剪切應力條件下，AHR siRNA對AHR的抑制顯著降低了硫酸吲哚酚誘導的TF上調（圖3 F）。

圖3   由剪切應力和IS誘導的組織因子（TF）表達依賴于AHR激活。

染料木素抑制剪切應力介導的但不是硫酸吲哚酚介導的 TF 表達

此外，研究了染料木素對剪切應力和IS介導的TF mRNA誘導的影響。在靜態條件下，染料木素顯著降低剪切應力誘導的TF mRNA表達，但不抑制 IS 誘導的TF mRNA表達。在剪切應力條件下用IS刺激的HUVEC中，染料木素部分抑制了TF表達。在剪切應力和染料木素條件下，IS刺激的HUVEC中的TF mRNA表達與在無染料木素的靜態條件下用IS刺激的HUVEC中的TF表達沒有差異。這表明，在剪切應力下用IS刺激的HUVEC中，染料木素抑制剪切應力介導的TF誘導，而不是IS介導的。

硫酸吲哚酚在流體剪切應力下增加 TF 的促凝血活性

為了確定剪切應力和IS引起的TF產生增加是否對凝血具有功能活性，實驗通過分析Xa因子（Xa 因子是凝血級聯中的一種關鍵酶）的產生來測量HUVEC中TF依賴性促凝血活性。

剪切應力（圖4）沒有增加HUVEC中的TF促凝血活性。在靜態條件下，IS 將 Xa 因子生成從對照細胞中的 0.96 ± 0.42 fM Xa/mg 蛋白增加到受 IS 刺激的細胞中的 6.28 ± fM Xa/mg 蛋白（圖4）。在剪切應力條件下，IS仍然將Xa因子生成增加到2.93±0.97 fM Xa/mg蛋白，但這種增幅小于靜態條件（圖4）。阻斷TF抗體消除了Xa因子的產生（圖4），證實了 Xa因子的生成與 TF 活性相關。

圖4   剪切應力和IS對TF促凝血劑活性的影響。

綜上所述，該研究表明，剪切應力和IS通過不同的通路激活了AHR，但兩者都以AHR依賴性的方式增加了TF表達。剪切應力不會誘導TF活性，而IS增加了TF活性，即使在抗血栓性剪切應力條件下也是如此。這支持了IS作為CKD中促血栓形成因子的作用。

參考文獻：Lano G, Laforêt M, Von Kotze C, Perrin J, Addi T, Brunet P, Poitevin S, Burtey S, Dou L. Aryl Hydrocarbon Receptor Activation and Tissue Factor Induction by Fluid Shear Stress and Indoxyl Sulfate in Endothelial Cells. Int J Mol Sci. 2020 Mar 31;21(7):2392. doi: 10.3390/ijms21072392. PMID: 32244284; PMCID: PMC7178278.

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