眼壓（IOP）是青光眼病理生理學的主要危險因素，不僅影響視網膜神經節細胞（RGCs）的凋亡，還影響視神經乳頭（ONH）的生物力學行為。篩板（LC）和視盤周圍鞏膜（PPS）主要構成ONH復合體，可能對青光眼的發展進展有較大影響。最近的發現引起了人們對高血壓鞏膜（hypertensive sclera）的生物力學特性的興趣，并探索了它與青光眼的關系。

細胞外基質（ECM）對于鞏膜維持眼壓產生的張力很重要。眼壓升高可能會增加小鼠鞏膜中的纖維成分（如膠原蛋白）并減少非纖維成分。 因此可以推測，高血壓性鞏膜改變可能表明ECM的合成而不是降解，至少在早期階段是這樣。駐留在鞏膜中的細胞的反應是關鍵點。因此，對鞏膜ECM重塑驅動力的機制洞察需要在體外機械應變下對人鞏膜成纖維細胞（HSFs），特別是視盤周圍HSFs（ppHSFs）進行詳細研究。為了研究高血壓PPS的ECM重塑，有必要在體外建立適當的ppHSFs應變模型，以模擬體內眼高壓。

因此，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院、衛生部近視眼重點實驗室、上海交通大學醫學院附屬新華醫院骨科等聯合團隊的一項研究旨在（1）探索ppHSFs在體外合適的雙軸機械應變;（2）篩選pHSFs在拉伸應變下的機械刺激基因;（3）研究CXCR2在機械應變下對細胞行為和ECM產生的影響。

多種機械應變下 ppHSFs 的 mRNA 和蛋白表達

為了探索合適的應變參數，在ppHSFs上施加了多個雙軸力學應變，幅度分別為：0；5%，0.5Hz；10%，0.5Hz；20%,0.5Hz，持續8h和24h。結果表明，這些基因在不同應變的影響下發生了動態變化。與對照相比，隨著機械應變的逐漸加強，I~IV型膠原蛋白、彈性蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA水平呈先升高后下降的趨勢，而MMP2、核心蛋白聚糖、纖連蛋白和雙糖鏈蛋白多糖的轉錄表達顯著降低。

多種應變下ppHSFs中I型膠原蛋白和MMP2的蛋白表達與轉錄水平一致。作為鞏膜中的主要成分，I型膠原蛋白占鞏膜干重的90%以上。在 5% 0.5 Hz、10% 0.5 Hz、20% 0.5 Hz 應變 8h和 24h下，I型膠原蛋白的折疊變化分別為1.59±0.36、1.62±0.39、0.58±0.13、1.12±0.18、0.90±0.13、1.40±0.36。與近視一樣，MMP2也可能在調節眼高壓期間的鞏膜重塑中起著至關重要的作用。MMP2的相對蛋白水平分別為0.45±0.10、0.60±0.16、0.83±0.17、0.91±0.11、1.17±0.22、0.99±0.19倍變化。

研究表明，高血壓鞏膜顯示纖維成分增加，非纖維成分減少，伴隨鞏膜硬度增加和鞏膜通透性降低。初步實驗還證實了大鼠慢性眼高壓模型中鞏膜I型膠原蛋白和彈性蛋白的產生上調，至少在早期階段是這樣。總之，10% 0.5Hz的應變持續8小時可能是合適的ppHSFs的應變條件，以模仿體內高血壓鞏膜ECM的產生。

機械刺激和未刺激的 ppHSFs 之間的 RNA 序列和 mRNA 表達譜

接下來比較機械刺激（10% 0.5 Hz，持續8小時）和未刺激的ppHSFs之間的mRNA表達。機械拉伸后轉錄組發生巨大改變（圖1 A）。結果表明，機械刺激觸發了促炎細胞因子簇，尤其是CXC配體和受體。因此進一步確認了CXC家族（CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5，CXCL12，CXCR2，CXCR5）在應變后哪個差異表達最大（圖1 B）。

異常刺激的CXCLs與ppHSFs中的上調CXCR2相結合，然后CXCR2可能將外部機械信號轉導為細胞內生物信號，調節下游信號通路，從而啟動炎癥級聯反應并改變細胞行為。此外還進行了蛋白質印跡分析以可視化應變下CXCR2的蛋白表達（圖1 C‐D）。因此，CXCR2可能是機械應變下ppHSFs的重要靶點。

為進一步研究CXCR2在ppHSFs中的功能，建立了含有人CXCR2基因shRNA的慢病毒載體。選擇shRNA1進行后續實驗，因為它在敲低CXCR2方面更有效（圖1 E-G）。

圖1   機械刺激和未刺激的ppHSFs之間的RNA序列和mRNA表達譜。

機械刺激的CXCR2促使ppHSFs在機械應變下增殖

在10% 0.5 Hz的應變下持續8 h，在ppHSFs中CXCR2的表達上調。然而，CXCR2對ppHSFs的影響尚未得到很好的探索。因此實驗檢測了細胞增殖能力。與未刺激的對照相比，刺激組中陽性Edu細胞（綠色）的比例增加，表明細胞增殖加快（圖2 A、B）。細胞周期分析也顯示ppHSFs中的G2和S期顯著增加（圖2 C、D）。數據還顯示，當CXCR2上調時，AKT，STAT3和ERK1/2的磷酸化增加，這可能解釋了機械刺激的細胞增殖（圖2 E、F）。免疫熒光成像顯示磷酸化的STAT3在相同情況下發生細胞核易位（圖2 G）。當CXCR2表達被shRNA敲低時，兩組之間的Edu成像沒有顯著變化。因此，CXCR2可能在機械應變下促進ppHSFs的細胞增殖。

圖2   機械刺激上調的CXCR2促使ppHSFs的細胞增殖。

機械刺激的 CXCR2 通過 Jak1/2‐STAT3 信號通路在機械應變下增加了 ppHSFs 中鞏膜 ECM 的產生

為了探討CXCR2對鞏膜ECM的mRNA和蛋白質產生的影響，進行了qPCR和蛋白質印跡。結果表明，應變刺激的CXCR2上調增加了I型膠原蛋白的mRNA和蛋白質產生，減少了siRNA對照組中MMP2的產生。當CXCR2表達受到抑制時，機械刺激后I型膠原蛋白和MMP2的mRNA和蛋白質產生被逆轉（圖3 A-C）。CXCR2還可以調節I型膠原蛋白的分泌水平和MMP2的活性。當CXCR3被敲低時，應變下磷酸化的STAT2的易位也減弱（圖3 D、E）。

通過應用JAK2/3抑制劑蘆可替尼也可以消除應變下I型膠原蛋白的增加，MMP1的減少和STAT2磷酸化的激活。因此，可以推測，機械刺激的CXCR2可能通過JAK1 / 2-STAT3信號通路調節ppHSFs中鞏膜ECM的產生。

圖3   機械刺激的CXCR2增加了機械應變下ppHSFs的鞏膜ECM產生

CXCR2對ppHSFs細胞凋亡的影響

采用膜聯蛋白V/PI雙重染色的流式細胞術分析細胞凋亡情況。結果表明，ppHSFs的凋亡在應變下略有降低，但無統計學意義。在shRNA干擾組中，應變后CXCR2的表達受到抑制，凋亡細胞明顯減少。結果表明，抑制 CXCR2可能降低ppHSFs的凋亡。

機械刺激的CXCR2通過FAK/MLC2通路減弱了機械應變下ppHSFs的細胞遷移

對于細胞遷移率，進行遷移測定。在siRNA對照組中，在有或無應變條件下，ppHSFs在劃痕后24h的遷移量分別占總遷移量的38.65% 和 59.16%。在shRNA組中，在有或無應變條件下，細胞的遷移量分別占總遷移量的 34.06% 和 37.12%（圖4 A、B）。在機械應變作用下，CXCR2的上調增加了磷酸化的FAK，但抑制了磷酸化的MLC2，從而降低了ppHSFs的遷移能力。然而，當CXCR2被敲低時，FAK和MLC2的磷酸化在應變后沒有顯著變化（圖4 C、D）。因此，CXCR2可能會影響ppHSFs在機械應變下的遷移能力。

此外，還應用了FAK抑制劑和DMSO。在對照（DMSO）組中，細胞遷移在機械應變下減慢。FAK的磷酸化上調，MLC2的磷酸化下調，與CXCR2 siRNA對照組的結果一致。然而，細胞遷移和MLC2的磷酸化在應用FAK抑制劑后恢復。總之，CXCR2可能通過FAK/MLC2信號通路抑制ppHSFs在應變下的遷移。

圖4   機械刺激的CXCR2在機械應變下延緩了ppHSFs中的細胞遷移。

綜上所述，該研究表明，10% 0.5 Hz 持續 8 小時的應變可能是 ppHSFs 重現體內高血壓鞏膜重塑的適當條件。在這種機械應變下，ppHSFs可能會經歷復雜的炎癥過程，至少在早期是這樣。上調的CXCR2可以促進細胞增殖，通過JAK1/2-STAT3信號通路調節I型膠原和基質金屬蛋白酶2的mRNA和蛋白表達，并通過FAK/MLC2通路抑制細胞遷移。機械轉導的機制可能值得進一步研究，包括microRNA等作用。機械應變可能誘導細胞microRNA的顯著變化，這表明microRNA可能是在機械刺激下調節ppHSFs的機制之一。總之，從鞏膜療法的角度來看，CXCR2可能是青光眼的潛在治療靶點。

參考文獻：Qiu C, Wang C, Sun X, Xu J, Wu J, Zhang R, Li G, Xue K, Zhang X, Qian S. CXC- receptor 2 promotes extracellular matrix production and attenuates migration in peripapillary human scleral fibroblasts under mechanical strain. J Cell Mol Med. 2022 Dec;26(23):5858-5871. doi: 10.1111/jcmm.17609. Epub 2022 Nov 8. PMID: 36349481; PMCID: PMC9716229.

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