眼壓（IOP）是青光眼病理生理學(xué)的主要危險(xiǎn)因素，不僅影響視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）的凋亡，還影響視神經(jīng)乳頭（ONH）的生物力學(xué)行為。篩板（LC）和視盤周圍鞏膜（PPS）主要構(gòu)成ONH復(fù)合體，可能對(duì)青光眼的發(fā)展進(jìn)展有較大影響。最近的發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)高血壓鞏膜（hypertensive sclera）的生物力學(xué)特性的興趣，并探索了它與青光眼的關(guān)系。

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）對(duì)于鞏膜維持眼壓產(chǎn)生的張力很重要。眼壓升高可能會(huì)增加小鼠鞏膜中的纖維成分（如膠原蛋白）并減少非纖維成分。 因此可以推測(cè)，高血壓性鞏膜改變可能表明ECM的合成而不是降解，至少在早期階段是這樣。駐留在鞏膜中的細(xì)胞的反應(yīng)是關(guān)鍵點(diǎn)。因此，對(duì)鞏膜ECM重塑驅(qū)動(dòng)力的機(jī)制洞察需要在體外機(jī)械應(yīng)變下對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞（HSFs），特別是視盤周圍HSFs（ppHSFs）進(jìn)行詳細(xì)研究。為了研究高血壓PPS的ECM重塑，有必要在體外建立適當(dāng)?shù)膒pHSFs應(yīng)變模型，以模擬體內(nèi)眼高壓。

因此，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院、衛(wèi)生部近視眼重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科等聯(lián)合團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究旨在（1）探索ppHSFs在體外合適的雙軸機(jī)械應(yīng)變;（2）篩選pHSFs在拉伸應(yīng)變下的機(jī)械刺激基因;（3）研究CXCR2在機(jī)械應(yīng)變下對(duì)細(xì)胞行為和ECM產(chǎn)生的影響。

多種機(jī)械應(yīng)變下 ppHSFs 的 mRNA 和蛋白表達(dá)

為了探索合適的應(yīng)變參數(shù)，在ppHSFs上施加了多個(gè)雙軸力學(xué)應(yīng)變，幅度分別為：0；5%，0.5Hz；10%，0.5Hz；20%,0.5Hz，持續(xù)8h和24h。結(jié)果表明，這些基因在不同應(yīng)變的影響下發(fā)生了動(dòng)態(tài)變化。與對(duì)照相比，隨著機(jī)械應(yīng)變的逐漸加強(qiáng)，I~IV型膠原蛋白、彈性蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA水平呈先升高后下降的趨勢(shì)，而MMP2、核心蛋白聚糖、纖連蛋白和雙糖鏈蛋白多糖的轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著降低。

多種應(yīng)變下ppHSFs中I型膠原蛋白和MMP2的蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)錄水平一致。作為鞏膜中的主要成分，I型膠原蛋白占鞏膜干重的90%以上。在 5% 0.5 Hz、10% 0.5 Hz、20% 0.5 Hz 應(yīng)變 8h和 24h下，I型膠原蛋白的折疊變化分別為1.59±0.36、1.62±0.39、0.58±0.13、1.12±0.18、0.90±0.13、1.40±0.36。與近視一樣，MMP2也可能在調(diào)節(jié)眼高壓期間的鞏膜重塑中起著至關(guān)重要的作用。MMP2的相對(duì)蛋白水平分別為0.45±0.10、0.60±0.16、0.83±0.17、0.91±0.11、1.17±0.22、0.99±0.19倍變化。

研究表明，高血壓鞏膜顯示纖維成分增加，非纖維成分減少，伴隨鞏膜硬度增加和鞏膜通透性降低。初步實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了大鼠慢性眼高壓模型中鞏膜I型膠原蛋白和彈性蛋白的產(chǎn)生上調(diào)，至少在早期階段是這樣。總之，10% 0.5Hz的應(yīng)變持續(xù)8小時(shí)可能是合適的ppHSFs的應(yīng)變條件，以模仿體內(nèi)高血壓鞏膜ECM的產(chǎn)生。

機(jī)械刺激和未刺激的 ppHSFs 之間的 RNA 序列和 mRNA 表達(dá)譜

接下來(lái)比較機(jī)械刺激（10% 0.5 Hz，持續(xù)8小時(shí)）和未刺激的ppHSFs之間的mRNA表達(dá)。機(jī)械拉伸后轉(zhuǎn)錄組發(fā)生巨大改變（圖1 A）。結(jié)果表明，機(jī)械刺激觸發(fā)了促炎細(xì)胞因子簇，尤其是CXC配體和受體。因此進(jìn)一步確認(rèn)了CXC家族（CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5，CXCL12，CXCR2，CXCR5）在應(yīng)變后哪個(gè)差異表達(dá)最大（圖1 B）。

異常刺激的CXCLs與ppHSFs中的上調(diào)CXCR2相結(jié)合，然后CXCR2可能將外部機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)，調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路，從而啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)并改變細(xì)胞行為。此外還進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析以可視化應(yīng)變下CXCR2的蛋白表達(dá)（圖1 C‐D）。因此，CXCR2可能是機(jī)械應(yīng)變下ppHSFs的重要靶點(diǎn)。

為進(jìn)一步研究CXCR2在ppHSFs中的功能，建立了含有人CXCR2基因shRNA的慢病毒載體。選擇shRNA1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗谇玫虲XCR2方面更有效（圖1 E-G）。

圖1   機(jī)械刺激和未刺激的ppHSFs之間的RNA序列和mRNA表達(dá)譜。

機(jī)械刺激的CXCR2促使ppHSFs在機(jī)械應(yīng)變下增殖

在10% 0.5 Hz的應(yīng)變下持續(xù)8 h，在ppHSFs中CXCR2的表達(dá)上調(diào)。然而，CXCR2對(duì)ppHSFs的影響尚未得到很好的探索。因此實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞增殖能力。與未刺激的對(duì)照相比，刺激組中陽(yáng)性Edu細(xì)胞（綠色）的比例增加，表明細(xì)胞增殖加快（圖2 A、B）。細(xì)胞周期分析也顯示ppHSFs中的G2和S期顯著增加（圖2 C、D）。數(shù)據(jù)還顯示，當(dāng)CXCR2上調(diào)時(shí)，AKT，STAT3和ERK1/2的磷酸化增加，這可能解釋了機(jī)械刺激的細(xì)胞增殖（圖2 E、F）。免疫熒光成像顯示磷酸化的STAT3在相同情況下發(fā)生細(xì)胞核易位（圖2 G）。當(dāng)CXCR2表達(dá)被shRNA敲低時(shí)，兩組之間的Edu成像沒(méi)有顯著變化。因此，CXCR2可能在機(jī)械應(yīng)變下促進(jìn)ppHSFs的細(xì)胞增殖。

圖2   機(jī)械刺激上調(diào)的CXCR2促使ppHSFs的細(xì)胞增殖。

機(jī)械刺激的 CXCR2 通過(guò) Jak1/2‐STAT3 信號(hào)通路在機(jī)械應(yīng)變下增加了 ppHSFs 中鞏膜 ECM 的產(chǎn)生

為了探討CXCR2對(duì)鞏膜ECM的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響，進(jìn)行了qPCR和蛋白質(zhì)印跡。結(jié)果表明，應(yīng)變刺激的CXCR2上調(diào)增加了I型膠原蛋白的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生，減少了siRNA對(duì)照組中MMP2的產(chǎn)生。當(dāng)CXCR2表達(dá)受到抑制時(shí)，機(jī)械刺激后I型膠原蛋白和MMP2的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生被逆轉(zhuǎn)（圖3 A-C）。CXCR2還可以調(diào)節(jié)I型膠原蛋白的分泌水平和MMP2的活性。當(dāng)CXCR3被敲低時(shí)，應(yīng)變下磷酸化的STAT2的易位也減弱（圖3 D、E）。

通過(guò)應(yīng)用JAK2/3抑制劑蘆可替尼也可以消除應(yīng)變下I型膠原蛋白的增加，MMP1的減少和STAT2磷酸化的激活。因此，可以推測(cè)，機(jī)械刺激的CXCR2可能通過(guò)JAK1 / 2-STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)ppHSFs中鞏膜ECM的產(chǎn)生。

圖3   機(jī)械刺激的CXCR2增加了機(jī)械應(yīng)變下ppHSFs的鞏膜ECM產(chǎn)生

CXCR2對(duì)ppHSFs細(xì)胞凋亡的影響

采用膜聯(lián)蛋白V/PI雙重染色的流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，ppHSFs的凋亡在應(yīng)變下略有降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在shRNA干擾組中，應(yīng)變后CXCR2的表達(dá)受到抑制，凋亡細(xì)胞明顯減少。結(jié)果表明，抑制 CXCR2可能降低ppHSFs的凋亡。

機(jī)械刺激的CXCR2通過(guò)FAK/MLC2通路減弱了機(jī)械應(yīng)變下ppHSFs的細(xì)胞遷移

對(duì)于細(xì)胞遷移率，進(jìn)行遷移測(cè)定。在siRNA對(duì)照組中，在有或無(wú)應(yīng)變條件下，ppHSFs在劃痕后24h的遷移量分別占總遷移量的38.65% 和 59.16%。在shRNA組中，在有或無(wú)應(yīng)變條件下，細(xì)胞的遷移量分別占總遷移量的 34.06% 和 37.12%（圖4 A、B）。在機(jī)械應(yīng)變作用下，CXCR2的上調(diào)增加了磷酸化的FAK，但抑制了磷酸化的MLC2，從而降低了ppHSFs的遷移能力。然而，當(dāng)CXCR2被敲低時(shí)，F(xiàn)AK和MLC2的磷酸化在應(yīng)變后沒(méi)有顯著變化（圖4 C、D）。因此，CXCR2可能會(huì)影響ppHSFs在機(jī)械應(yīng)變下的遷移能力。

此外，還應(yīng)用了FAK抑制劑和DMSO。在對(duì)照（DMSO）組中，細(xì)胞遷移在機(jī)械應(yīng)變下減慢。FAK的磷酸化上調(diào)，MLC2的磷酸化下調(diào)，與CXCR2 siRNA對(duì)照組的結(jié)果一致。然而，細(xì)胞遷移和MLC2的磷酸化在應(yīng)用FAK抑制劑后恢復(fù)。總之，CXCR2可能通過(guò)FAK/MLC2信號(hào)通路抑制ppHSFs在應(yīng)變下的遷移。

圖4   機(jī)械刺激的CXCR2在機(jī)械應(yīng)變下延緩了ppHSFs中的細(xì)胞遷移。

綜上所述，該研究表明，10% 0.5 Hz 持續(xù) 8 小時(shí)的應(yīng)變可能是 ppHSFs 重現(xiàn)體內(nèi)高血壓鞏膜重塑的適當(dāng)條件。在這種機(jī)械應(yīng)變下，ppHSFs可能會(huì)經(jīng)歷復(fù)雜的炎癥過(guò)程，至少在早期是這樣。上調(diào)的CXCR2可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過(guò)JAK1/2-STAT3信號(hào)通路調(diào)節(jié)I型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶2的mRNA和蛋白表達(dá)，并通過(guò)FAK/MLC2通路抑制細(xì)胞遷移。機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制可能值得進(jìn)一步研究，包括microRNA等作用。機(jī)械應(yīng)變可能誘導(dǎo)細(xì)胞microRNA的顯著變化，這表明microRNA可能是在機(jī)械刺激下調(diào)節(jié)ppHSFs的機(jī)制之一。總之，從鞏膜療法的角度來(lái)看，CXCR2可能是青光眼的潛在治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Qiu C, Wang C, Sun X, Xu J, Wu J, Zhang R, Li G, Xue K, Zhang X, Qian S. CXC- receptor 2 promotes extracellular matrix production and attenuates migration in peripapillary human scleral fibroblasts under mechanical strain. J Cell Mol Med. 2022 Dec;26(23):5858-5871. doi: 10.1111/jcmm.17609. Epub 2022 Nov 8. PMID: 36349481; PMCID: PMC9716229.

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