間充質干細胞（MSCs）已被應用于治療各種不治之癥，并且大量研究已經探索了與其治療特性相關的旁分泌和抗炎作用。已知間充質干細胞會遷移到受損組織或炎癥部位，在那里它們受到干擾素（IFN）-γ、TNF-α或白細胞介素（IL）-1β等炎性細胞因子的刺激，以表達各種免疫抑制因子，包括吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激基因-6（TSG-6）、一氧化氮（NO）、IL-6、IL-10等。巨噬細胞在炎癥部位分泌包括TNF-α和IL-1β在內的各種炎性細胞因子，它們可以通過間充質干細胞誘導TSG-6的表達。

TSG-6是一種與炎癥相關的多功能蛋白，具有抗炎和組織保護特性。此外，TSG-6在炎性細胞遷移、細胞增殖和發育過程中起重要作用。TSG-6可通過調節內皮細胞、中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞泡沫細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞的遷移和增殖來抑制炎癥反應。TSG-6可通過抑制TGF-β信號通路來調節成纖維細胞的生長，從而達到抗纖維化的效果。

暴露于炎癥環境的MSCs可以通過表達TSG-6來調節炎癥細胞的活性來再生受損組織。盡管包括TNF-α和IL-1β在內的炎性細胞因子可以增加TSG-6表達，但對MSCs和巨噬細胞之間TSG-6表達的關系知之甚少。

基于此，韓國延世大學原州醫學院外科、內科以及醫學研究中心的研究團隊假設在不同過渡狀態的巨噬細胞相關的間充質干細胞中，TSG-6的表達可能存在差異。因此，在一項研究中，研究人員希望確定巨噬細胞的哪些轉移狀態可能參與脂肪干細胞（ASCs）中的TSG-6表達，哪些類型的細胞因子對TSG-6表達很重要，以及哪些信號通路可以調節TSG-6表達。為了探索這些問題，研究了TSG-6在ASCs和M0、M1和M2巨噬細胞間接共培養后的表達以及ASCs中TSG-6表達的最佳條件。此外，針對TSG-6的抗纖維化作用，研究了表達TSG-6的ASCs和巨噬細胞是否能夠緩解TGF-β誘導的肝星狀細胞纖維化。

與巨噬細胞共培養后 ASCs 中 TSG-6 mRNA 的表達增加

由于MSCs在炎癥環境中誘導TSG-6表達，因此研究了MSCs中的TSG-6表達是否因巨噬細胞的轉換狀態而不同。ASCs單獨培養或與巨噬細胞共培養，并分別用IFN-γ和LPS或IL-4和IL-13處理，它們分別促進巨噬細胞向M1或M2表型的轉變，然后分析TSG-6表達。結果表明，無論巨噬細胞轉化狀態如何，都會增加ASCs中的TSG-6表達。M0 和 M2 巨噬細胞分別使 TSG-6 表達增加了 5 倍和 15 倍，而 M1 巨噬細胞顯著增加了 ASCs 中的 TSG-6 表達約 62 倍（圖1）。這些結果表明，與巨噬細胞共培養增加了ASCs中TSG-6的表達，并且M1巨噬細胞或促炎性條件可能在ASCs的TSG-6表達中起特別重要的作用。

接下來，分析了巨噬細胞是否對ASCs中的TSG-6表達至關重要，以及TSG-6是否在巨噬細胞中表達。ASCs單獨培養或與巨噬細胞共培養，并用IFN-γ和LPS（促進M1表型的巨噬細胞轉化因子）處理。在用IFN-γ和LPS處理的ASCs中，TSG-6表達增加了約21倍，而與M0巨噬細胞共培養的ASCs中TSG-6表達增加了約10倍。有趣的是，當ASCs與M1巨噬細胞共培養時，ASCs和M1巨噬細胞中的TSG-6 mRNA分別增加了約63倍和46倍。此外，使用小鼠巨噬細胞Raw 264.7分析了巨噬細胞對ASCs中TSG-6 的表達是否是特異性所必需的。結果表明，與由 THP-1 分化的 M1 巨噬細胞類似，用 LPS 處理的 Raw264.7 細胞顯著誘導 ASCs 中的 TSG-6 表達。這些結果表明，如果巨噬細胞和間充質干細胞共存于炎癥或損傷部位，它們都過度表達TSG-6。

圖1   與巨噬細胞間接共培養的ASCs中的TSG-6 mRNA表達。ASCs與巨噬細胞間接共培養2天，并通過qPCR評估TSG-6 mRNA表達。

用細胞因子組合處理的 ASCs 和巨噬細胞中的 TSG-6 表達

由于巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-1β可以誘導TSG-6表達，因此實驗研究了IFN-γ和LPS、TNF-α或IL-1β是否在ASCs中TSG-6表達的增加中起作用。在用IFN-γ和LPS，TNF-α或IL-1β單獨處理的ASCs中，僅在長時間（300秒）后檢測到升高的TSG-6水平。然而，在用IFN-γ，LPS和TNF-α聯合處理的ASCs中，即使在短時間（22秒）也觀察到TSG-6表達顯著增加，這種增加取決于TNF-α的劑量（圖2 A，lanes 5和6），但不是 IL-1β （圖2 A，lanes 7和8）。然而，當用四種因子處理細胞時，觀察到最大的TSG-6表達（圖2 A，lanes 9 和10）。這些結果表明，幾種炎性細胞因子的協同作用是TSG-6在ASCs中最佳表達所必需的。

相比之下，與用IFN-γ和LPS處理的細胞相比，用IFN-γ、LPS和TNF-α組合處理觀察到巨噬細胞中的TSG-6表達增加（圖2 B，lanes 5）。這些結果表明，誘導TSG-6表達的條件因細胞類型而異，并且ASCs可以通過比巨噬細胞更敏感地對炎癥條件做出反應來表達TSG-6。

圖2   TSG-6在用TNF-α，IL-1β和/或IFN-γ + LPS處理的ASCs和巨噬細胞中的表達。用不同濃度的TNF-α、IL-1β和/或IFN-γ（20 ng/mL）+ LPS（10pg/mL）處理ASCs或巨噬細胞48 h，采用免疫印跡法檢測細胞裂解物和培養上清液中TSG-6表達。（A） ASCs中的TSG-6表達。（B）巨噬細胞中的TSG-6表達。

TSG-6 表達的信號轉導者和轉錄激活者（STAT）信號通路的激活

接下來，研究了由IFN-γ和LPS激活的STAT通路是否參與TSG-6表達。

在ASCs和巨噬細胞中，IFN-γ + LPS處理，但不是TNF-α或IL-1β處理，誘導STAT1/3在15分鐘磷酸化。抑制STAT活性的Janus激酶（JAK）抑制劑降低了細胞因子聯合處理誘導的TSG-6表達（圖3 A）。此外，在間接共培養的ASCs和巨噬細胞中也觀察到TSG-6表達的降低（圖3 B、C）。這些結果表明，STAT信號通路誘導ASCs和巨噬細胞中的TSG-6表達。此外，STAT活性誘導了TNF-α + IL-1β處理過程中TSG-6的協同表達。

總之，IFN-γ + LPS、TNF-α或IL-1β可以在ASCs和巨噬細胞中誘導TSG-6表達，當ASCs和巨噬細胞在STAT激活條件下暴露于TNF-α或IL-1β時，可能會出現TSG-6過表達。

圖3    JAK抑制劑抑制TSG-6表達。在細胞因子處理或共培養前20分鐘用JAK抑制劑（JAK1和JAK2抑制劑各10μM）處理細胞。刺激后48 h回收細胞裂解物，并使用免疫印跡分析TSG-6表達。（A）用TNF-α，IL-1β和/或IFN-γ + LPS處理后ASCs中的TSG-6表達。共培養后ASCs（B）或巨噬細胞（C）中的TSG-6表達。

TSG-6 在 ASCs 和巨噬細胞中表達的抗纖維化作用

TSG-6除了具有代表性的抗炎特性外，還可通過調節TGF-β/Smad通路來調節纖維化。因此，實驗研究了ASCs和巨噬細胞表達的TSG-6是否可以調節TGF-β誘導的LX-2（人肝星狀細胞）細胞的纖維化過程。

在LX-2細胞中，TGF-β誘導Smad3磷酸化和α-SMA表達，TSG-6顯著降低了這些表達（圖4 A、B）。此外，TGF-β誘導的α-SMA表達在與ASCs和巨噬細胞間接共培養的LX-2細胞中顯著降低。

接下來，為了確定LX-2中α-SMA表達的降低是否依賴于ASCs和巨噬細胞表達的TSG-6，使用siRNA研究了TSG-6沉默后α-SMA的表達。結果表明，TSG-6 siRNA 處理的 ASCs 和 Raw 264.7 巨噬細胞中 TSG-6 表達顯著降低，導致TGF-β暴露的LX-2細胞中α-SMA表達的恢復。

這些結果表明，TSG-6可以通過抑制LX-2細胞中的Smad3磷酸化來降低α-SMA表達，ASCs和巨噬細胞表達的TSG-6調節LX-2細胞的纖維化活性。

圖4   TSG-6在TGF-β處理的LX-2細胞中的抗纖維化作用。

（A）TSG-6在TGF-β處理的LX-2細胞中抑制α-SMA表達。（B）TSG-6抑制Smad3磷酸化。下室中的LX-2細胞與接種在上室的ASCs和巨噬細胞共培養。抑制α-SMA的表達在與ASCs和巨噬細胞共培養的LX-2細胞中（C）或ASCs和RAW 264.7巨噬細胞中（D）。

這些研究結果表明，通過激活STAT1/3增加TSG-6表達，全面的炎癥微環境可能在確定ASCs的治療特性方面發揮重要作用。總之，考慮MSC移植過程中的炎癥環境對于增強MSCs和巨噬細胞表達的TSG-6的抗炎和抗纖維化特性非常重要。

參考文獻：Gong SC, Yoon Y, Jung PY, Kim MY, Baik SK, Ryu H, Eom YW. Antifibrotic TSG-6 Expression Is Synergistically Increased in Both Cells during Coculture of Mesenchymal Stem Cells and Macrophages via the JAK/STAT Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2022 Oct 28;23(21):13122. doi: 10.3390/ijms232113122. PMID: 36361907; PMCID: PMC9656625.

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