骨關節炎（OA）是最常見的年齡相關性關節疾病，可引起關節疼痛和腫脹。多種因素（包括過度機械負荷和系統性代謝異常）有助于臨床OA的發生，但不同關節之間每種因素的權重可能不同。

在細胞水平上，骨關節炎是軟骨結構和功能的逐漸喪失。在正常情況下，軟骨細胞分泌II型膠原蛋白和蛋白聚糖以維持軟骨基質。然而，在OA的進展過程中，軟骨細胞通過去分化過程發生表型變化。

OA的分子標志是滑膜微環境中炎性細胞因子升高。這些炎性細胞因子包括IL-6和IL-8。在OA患者的滑液和血清中觀察到這兩種細胞因子水平升高。此外，IL-1β和TNFα與OA進展有關。IL-1β和TNFα的表達被NFκB和AP-1轉錄因子激活，從而誘導其他細胞因子和介質（包括MMP9、MMP13和IL-6）的自分泌產生，進一步刺激炎癥。

NOTCH1信號對于發育和維持干細胞至關重要。在骨骼和軟骨發育過程中，NOTCH1通過激活SOX9的表達來促進軟骨細胞的分化。證據還顯示，NOTCH1經常在OA軟骨的軟骨細胞中被激活。因此，NOTCH1信號的激活可能在OA的發病機制中起重要作用。除了調節基質形成外，NOTCH1還能夠維持NFκB的激活，并與滑膜細胞和軟骨細胞炎性細胞因子表達的增加有關，從而促進OA的進展。盡管 NOTCH1 可能參與 OA 進展，但 NOTCH1 在軟骨細胞中的確切功能仍有待說明。

據報道，NOTCH1是內皮細胞中的機械力傳感器。中國臺灣省國立中正大學生物醫學系、國立嘉義大學生化科學與技術系的一項研究曾報道了流體剪切力誘導NOTCH1下游基因以及炎性細胞因子和趨化因子的立即上調。數據表明，NOTCH1信號作為一個傳感器來傳遞機械壓力，并誘導軟骨細胞中炎癥細胞因子的表達。

軟骨細胞剪切應力即時反應基因的鑒定

為了研究機械負荷對軟骨細胞功能的影響，實驗以低（2 dynes/cm2）或高（15 dynes/cm2）水平的平行方向流體剪切力培養了人軟骨細胞系SW1353。通過RNA測序確定流體剪切力處理前后的基因表達譜。

在上調基因中，80個蛋白質編碼基因在剪切應力下表現出超過四倍的增加。在這些高活化的基因中，61個基因在低剪切應力和高剪切應力下上調（圖1 B），而僅在高剪切應力下的SW1353細胞中，有19個基因上調超過四倍。GO富集分析表明，這些上調基因的分子功能是細胞因子信號傳導和轉錄調控。這些數據表明，軟骨細胞對流體剪切力應力的主要細胞反應是炎癥反應的激活。

對數據集的檢查顯示，參與炎癥過程的許多基因包括幾種炎癥細胞因子和趨化因子（圖1 C）。在靜態條件下，IL-8和CCL3的表達水平極低，但在剪切應力下2 h，兩個基因的表達水平均增加了近百倍。除IL-8和CCL3外，TNFα和CSF2在未經處理的細胞中檢測不到，并且在施加剪切應力后顯著增加。與TNFα表達的增加相關，TNFAIP3和TRAF1的水平也急劇增加（圖1 C）。TRAF1和TNFAIP3先前都被確定為骨關節炎相關標志物。再加上TNFα表達的增加，這些數據表明，剪切應力激活了TNF信號傳導。TNFAIP3具有抑制NFκB激活和TNFα介導的細胞凋亡的功能。此外，NFκB抑制劑NFKB1A和NFKB1Z的表達也增加（圖1 C）。

圖1   鑒定SW1353中的流體剪切力應力立即響應基因

（A）SW1353細胞經受低（2 dynes/cm2） 或高（15 dynes/cm2）平行流體剪切力30分鐘。（B）79和81個基因在低剪切應力和高剪切應力下分別上調了四倍以上。在這兩個數據集中，發現61個基因上調。在低剪切應力和高剪切應力下，下調超過4倍的基因數量分別為4個和1個。（C）顯示所選剪切應力激活基因的表達水平。

NOTCH1誘導炎癥細胞因子

除了免疫調節中的基因功能外，還發現JAG1和HES1表達增加（圖1 C）。鑒于JAG1是NOTCH1受體的配體，HES1是激活的NOTCH1信號通路的下游靶標，實驗數據表明，NOTCH1信號是由流體剪切力激活的。

以往研究表明，NOTCH1的激活與炎癥細胞因子的產生有關。然而，尚不清楚NOTCH1的激活是否直接誘導軟骨細胞中炎癥細胞因子的表達。為了探索這種可能性，創建了一個EGFP-NOTCH1 PEST結構域刪除的細胞內結構域（N1C?PEST）構建體，并在SW1353中瞬時表達EGFP-N1C?PEST以模擬NOTCH1的激活。通過RNA測序分析SW1353表達譜的變化。測序結果顯示，模擬NOTCH1激活4 h后，在SW1353中，139個基因增加4倍，6個基因表達減少（圖2 A）。對這些上調基因的分析表明，NOTCH1信號誘導細胞因子、干擾素、干擾素反應基因、趨化因子和免疫應答調節因子的表達。

將NOTCH1激活基因與流體剪切力應力數據集交叉引用表明，許多流體剪切力應力激活基因也對NOTCH1信號有反應。這些基因包括細胞因子IL-8和TNF以及NFκB信號調控因子NFKB1A、NFKB1Z、TNFAIP3和TRAF1（圖2 B）。這一觀察結果表明，NOTCH1的激活是流體剪切力應力處理的直接事件，激活的NOTCH1信號反過來誘導細胞因子和免疫調節因子的表達。因此，這些數據表明，NOTCH1在機械力加載的軟骨中起誘導炎癥反應的作用。

此外，觀察到III型干擾素急劇增加，包括IFNL1、IFNL2和IFNL3（圖2 B）。許多已知干擾素反應基因的表達也隨著干擾素產生的增加而增加（圖2 B）。除細胞因子外，參與免疫反應調控的基因也上調。在這些NOTCH1激活基因中，顯著的基因是由CD274編碼的PD-L1。PD-L1是抗癌免疫治療的靶標，但其在OA中的作用尚不清楚。

圖2   鑒定SW1353中的NOTCH1激活基因

（A）SW1353用pEGFP-C1和pEGFP-N1C?PEST轉染2小時，并在新鮮培養基中再孵育2小時。收獲細胞用于通過RNA測序分析基因表達。（B）NOTCH1誘導的基因根據其功能分為干擾素，干擾素反應基因，細胞因子，趨化因子和免疫調節因子。

為了確認RNA測序的結果，進行了獨立的轉染實驗，并通過定量RT-PCR檢查了IL-8、TNF、IFNB1和IFNL1的表達水平。qRT-PCR結果與測序數據一致，表明IL-8、IFNB1和IFNL1顯著增加（圖3 A）。通過ELISA測定了轉染細胞培養基中IL-8的水平。結果表明，在激活的NOTCH1表達后8 h，培養物中IL-8蛋白水平急劇升高（圖3 B）。因此，這些數據表明，流體剪切力應力誘導的炎癥反應至少部分是由NOTCH1信號激活介導的。

圖3   通過qRT-PCR和ELISA確認NOTCH1激活基因

（A）EGFP和EGFP-N1C?PEST在SW1353中瞬時表達。轉染開始4小時后，提取總RNA，并通過qRT-PCR分析IL-8、TNF、IFNB1和IFNL1的表達水平。（B）轉染后2小時、4小時和8小時收集培養基。培養基中IL-8的水平由ELISA測定。

NOTCH1誘導的細胞因子對成骨細胞的影響

OA的常見癥狀是骨刺的生長。一種可能性是來自軟骨細胞的NOTCH1誘導的細胞因子隨后影響成骨細胞的功能。為了探索這種可能性，實驗用EGFP或N1C?PEST轉染SW1353 2小時。

在條件培養基下4小時，在用EGFP條件培養基處理的hFOB 1.19細胞中，9個基因顯示出超過四倍的增加，而9個基因顯示出超過四倍的減少。相比之下，在N1C?PEST條件培養基中孵育的hFOB 1.19具有28個上調基因和5個下調基因，變化大于4倍（圖4 A）。 對數據的檢查表明，這些由N1C?PEST -條件培養基誘導的基因在炎癥和免疫調節中起作用（圖4 B）。

圖4   通過來自N1C?PEST轉染SW1353的條件培養基上調成骨細胞系hFOB中的細胞因子和趨化因子

（A）在條件培養基下4小時，通過RNA測序分析hFOB的表達譜。（B）條件培養基誘導基因根據其作為趨化因子，細胞因子和免疫調節因子的功能進行分組。

對RNA測序數據的分析表明，在條件培養基下的延長培養過程中，誘導基因的水平開始下降。具體來說，CCL2在24小時后返回到未處理細胞的水平。雖然CXCL2、IFNB1和INFL1的水平沒有恢復到未經處理的水平，但仍顯示出顯著下降（圖5 A）。另一方面，雖然用EGFP條件培養基處理的hFOB中，CXCL11的表達水平在延長培養后也有所增加，但CXCL11的表達量保持在相似的水平（圖5 A）。為確認RNA測序結果，進行了獨立實驗，通過qRT-PCR證實了CXCL2、CXCL11、IFNB1和IFNL1的表達變化（圖5 B）。結果表明，軟骨細胞釋放的細胞因子對鄰近成骨細胞具有短期刺激作用，導致炎性細胞因子在周圍環境中進一步積累。

圖5   通過N1C?PEST轉染的SW1353條件培養基激活成骨細胞系hFOB中的細胞因子表達

（A）0、4和24小時后，從條件hFOB中收集RNA并通過RNA測序進行分析。（B）另外進行了兩項獨立實驗。采用qRT-PCR測定CCL2、CXCL2、CXCL11和IFNB1的表達水平。

在這項研究中，使用人軟骨細胞系SW1353來鑒定流體剪切力應力-即時反應基因。在施加剪切應力時，NOTCH1配體JAG1和下游靶基因HES1迅速而急劇地上調，提供了獨立的實驗證據，證明NOTCH1在軟骨細胞中被機械力激活。NOTCH1已被證明可作為內皮細胞中的機械力傳感器。結合實驗數據，這些發現表明，NOTCH1在應力承載組織中具有機械力傳感器和信號傳感器的功能。

參考文獻：Cheng HJ, Hsu WT, Chen CN, Li C. Activation of NOTCH1 by Shear Force Elicits Immediate Cytokine Expression in Human Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2020 Jul 14;21(14):4958. doi: 10.3390/ijms21144958. PMID: 32674293; PMCID: PMC7404062.

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