在全球范圍內(nèi)，食道癌是第七大常見(jiàn)癌癥。食管癌由兩種主要的組織學(xué)類(lèi)型組成，包括食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）。ESCC發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素包括飲酒、吸煙、高淀粉飲食等，但具體機(jī)制尚不清楚。

腫瘤微環(huán)境（TME）可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。TME包括各種基質(zhì)細(xì)胞，例如癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）、其他非惡性細(xì)胞，和細(xì)胞外成分（細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)等）。CAFs通過(guò)介導(dǎo)腫瘤增殖、遷移和侵襲的激活，以及誘導(dǎo)血管生成、刺激轉(zhuǎn)移等在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。CAFs可能來(lái)源于骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）、常駐成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和上皮細(xì)胞。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αSMA）和成纖維細(xì)胞活化蛋白（FAP）是CAFs的代表性細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)升高與幾種癌癥的預(yù)后較差有關(guān)。研究表明，CAFs通過(guò)與TME的其他基質(zhì)成分（如TAMs）相互作用間接促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

在日本神戶(hù)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科團(tuán)隊(duì)先前的一項(xiàng)研究中，表征了ESCC中CAFs的腫瘤促進(jìn)能力和免疫抑制表型的機(jī)制。此外，在MSCs和ESCC細(xì)胞之間進(jìn)行共培養(yǎng)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的MSCs中FAP表達(dá)增加。這些FAP陽(yáng)性MSCs，實(shí)驗(yàn)將其定義為CAF樣細(xì)胞，通過(guò)分泌C-C基序趨化因子配體2（CCL2）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）來(lái)促進(jìn)ESCC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移能力，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2極化。然而，CAFs、M2極化巨噬細(xì)胞（所謂的TAMs）和ESCC細(xì)胞之間的相互作用尚未詳細(xì)闡明。

為了探索CAFs增強(qiáng)ESCC進(jìn)展的機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)在體外通過(guò)將MSCs與ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)建立CAF樣細(xì)胞，通過(guò)cDNA微陣列分析比較了單培養(yǎng)MSCs和CAF樣細(xì)胞之間的基因表達(dá)譜，并表征了CAF樣細(xì)胞對(duì)ESCC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響。此外，確定了ESCC微環(huán)境中CAF樣細(xì)胞促進(jìn)腫瘤作用的可能關(guān)鍵參與者，這些細(xì)胞可能被用作ESCC治療的潛在靶點(diǎn)。

MSCs 和CAF樣細(xì)胞對(duì)PAI-1的表達(dá)

通過(guò)間接共培養(yǎng)法評(píng)估CAFs在ESCC微環(huán)境中的功能（圖1 a）。在與三種TE-系列ESCC細(xì)胞：TE-8、TE-9、TE15細(xì)胞共培養(yǎng)的MSCs中誘導(dǎo)FAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平。接下來(lái)將與TE-8、TE-9和TE-15細(xì)胞共培養(yǎng)的MSCs分別定義為CAF樣細(xì)胞：CAF8、CAF9和CAF15細(xì)胞（圖1 a）。通過(guò)比較單培養(yǎng)MSCs和CAF樣細(xì)胞的基因表達(dá)譜，在CAF9中確定了110個(gè)上調(diào)的基因和128個(gè)下調(diào)的基因。熱圖顯示了CAF9中上調(diào)基因中高表達(dá)的前50個(gè)基因（圖1 b）。不同細(xì)胞組中CAF9和CAF15的基因表達(dá)模式尤為相似。單培養(yǎng)的MSCs具有與CAF樣細(xì)胞不同的表達(dá)模式。

在這項(xiàng)研究中，重點(diǎn)研究了絲氨酸蛋白酶抑制劑E1（SERPINE1），這是CAF樣細(xì)胞中上調(diào)且高表達(dá)的基因之一（圖1 b）。通過(guò)qRT-PCR證實(shí)了SERPINE1 mRNA以及IL6、CCL2和CXCL12 mRNA在CAF樣細(xì)胞中的高表達(dá)水平（圖1 c）。CAF樣細(xì)胞分泌的PAI-1（纖溶酶原激活物抑制劑-1，由SERPINE1編碼）的濃度明顯高于單培養(yǎng)的MSCs（圖1 d）。ELISA的結(jié)果驗(yàn)證了ESCC細(xì)胞，特別是TE-8和TE-9細(xì)胞中PAI-1的分泌（圖1 d）。

圖1   PAI-1在CAF樣細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)和分泌

針對(duì)PAI-1的中和抗體抑制CAF樣細(xì)胞誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞遷移

與CAF樣細(xì)胞CAF8、CAF9和CAF15細(xì)胞共培養(yǎng)，分別顯著誘導(dǎo)了3種TE-系列ESCC細(xì)胞TE-8、TE-9和TE-15細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2 a、b）。添加針對(duì)PAI-1的中和抗體顯著抑制了與CAF樣細(xì)胞共培養(yǎng)的ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖2 c、d）。

圖2   CAF樣細(xì)胞分泌的PAI-1促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲

PAI-1通過(guò)激活Akt和Erk1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲

使用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)了PAI-1受體LRP1在三個(gè)TE-系列ESCC細(xì)胞中的表達(dá)（圖3 a、b）。為了研究PAI-1對(duì)ESCC細(xì)胞表型和信號(hào)通路的影響，將rhPAI-1應(yīng)用于TE-8、TE-9和TE-15細(xì)胞。rhPAI-1顯著促進(jìn)了ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（圖3 c、d）。此外，rhPAI-1促進(jìn)TE-8和TE-9細(xì)胞的遷移。rhPAI-1在處理10或30分鐘后增加p-Akt（Ser473 / Thr308）和p-Erk1/2水平（圖3 e）。PI3K抑制劑LY294002和MEK1/2抑制劑PD98059抑制了rhPAI-1處理的ESCC細(xì)胞中遷移和侵襲的誘導(dǎo)（圖3 f、g）。

圖3   PAI-1通過(guò)激活Akt和Erk1/2信號(hào)通路促進(jìn) ESCC 細(xì)胞的遷移和侵襲

PAI-1促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲，并通過(guò)LRP1激活信號(hào)通路

為了闡明PAI-1是否通過(guò)LRP1影響ESCC細(xì)胞的表型和信號(hào)傳導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾抑制了三個(gè)TE-系列ESCC細(xì)胞中的LRP1 mRNA。結(jié)果表明，敲低ESCC細(xì)胞中LRP1顯著抑制了rhPAI-1誘導(dǎo)的遷移和侵襲。在ESCC細(xì)胞中LRP1敲低后，p-Akt和p-Erk1/2水平降低。

PAI-1通過(guò)LRP1激活Akt和Erk1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的遷移和侵襲

實(shí)驗(yàn)通過(guò)與上述相同的方法證實(shí)了PAI-1對(duì)巨噬細(xì)胞的影響。與CAF樣細(xì)胞共培養(yǎng)顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的遷移和侵襲。針對(duì)PAI-1的中和抗體顯著抑制了CAF樣細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移和侵襲。使用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡證實(shí)了LRP1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)rhPAI-1顯著促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的遷移和侵襲能力，觀察到rhPAI-1在處理10分鐘后增加了巨噬細(xì)胞中的p-Akt和p-Erk1/2水平。然而，rhPAI-1不影響巨噬細(xì)胞的M2極化。LY294002和PD98059抑制了rhPAI-1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移和侵襲能力。接下來(lái)，通過(guò)RNA干擾抑制巨噬細(xì)胞中的LRP1 mRNA，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中LRP1的敲低抑制了rhPAI-1誘導(dǎo)的遷移和侵襲。PAI-1誘導(dǎo)的p-Akt和p-Erk1/2的水平也因巨噬細(xì)胞中LRP1的敲低而降低。

PAI-1 和 LRP1 表達(dá)水平與 ESCC 患者的臨床病理因素和預(yù)后相關(guān)

為了明確PAI-1和LRP1的表達(dá)水平是否與ESCC患者的臨床病理因素相關(guān)，實(shí)驗(yàn)對(duì)69例人ESCC組織中的PAI-1和LRP1進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。根據(jù)PAI-1在基質(zhì)細(xì)胞中的免疫反應(yīng)性和LRP1在癌細(xì)胞（CA）或基質(zhì)細(xì)胞（ST）中的免疫反應(yīng)性將ESCC組織分為高表達(dá)組和低表達(dá)組（圖4 a、b、c、d），并通過(guò)雙重免疫熒光確認(rèn)包括CD204⁺ TAMs在內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞在人ESCC組織中表達(dá)LRP1（圖4 e）。研究發(fā)現(xiàn)PAI-1在腫瘤基質(zhì)中的高表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度、αSMA和FAP的高表達(dá)水平以及大量浸潤(rùn)的CD204⁺巨噬細(xì)胞密切相關(guān)。LRP1（CA）的高表達(dá)水平與FAP的高表達(dá)水平和大量浸潤(rùn)的CD204⁺巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)。LRP1（ST）的高表達(dá)水平與性別、腫瘤浸潤(rùn)深度、αSMA和FAP的高表達(dá)水平以及大量浸潤(rùn)的CD204⁺巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)。

接下來(lái)，分析了PAI-1和LRP1表達(dá)的預(yù)后值。分析顯示，PAI-1和LRP1（ST）高表達(dá)水平的患者無(wú)病生存期（DFS）明顯較短，LRP1（CA）高表達(dá)水平的患者腫瘤特異性生存期（CSS）明顯較短。PAI-1、LRP1（CA）或LRP1（ST）表達(dá)對(duì)患者的總生存期沒(méi)有顯著影響。

接下來(lái)，根據(jù)PAI-1和LRP1（CA）免疫反應(yīng)性評(píng)分的組合將患者分為三組。PAI-1和LRP1（CA）均高表達(dá)的患者與PAI-1和LRP1（CA）均低表達(dá)的患者相比，DFS和CSS顯著縮短。與PAI-1和LRP1（CA）表達(dá)水平低的患者相比，PAI-1或LRP1（CA）高表達(dá)水平的患者DFS明顯較短。同樣，根據(jù)PAI-1和LRP1（ST）免疫反應(yīng)性評(píng)分的組合將患者分為三組。PAI-1和LRP1（ST）表達(dá)水平高的患者與PAI-1和LRP1（ST）表達(dá)水平低的患者相比，DFS和CSS表達(dá)水平明顯較短。此外，PAI-1和LRP1（ST）高表達(dá)水平的患者與PAI-1或LRP1（ST）低表達(dá)水平的患者相比，DFS明顯較短。

圖4   PAI-1和LRP1在人ESCC組織中的表達(dá)

總之，該研究證明了來(lái)源于CAFs的PAI-1通過(guò)與LRP1相互作用，通過(guò)Akt和Erk1/2的磷酸化促進(jìn)了ESCC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和侵襲。CAFs 中的 PAI-1 是 ESCC 患者的潛在預(yù)后因素。因此，靶向PAI-1/LRP1軸可能是ESCC的一種治療方法。

參考文獻(xiàn)：Sakamoto H, Koma YI, Higashino N, Kodama T, Tanigawa K, Shimizu M, Fujikawa M, Nishio M, Shigeoka M, Kakeji Y, Yokozaki H. PAI-1 derived from cancer-associated fibroblasts in esophageal squamous cell carcinoma promotes the invasion of cancer cells and the migration of macrophages. Lab Invest. 2021 Mar;101(3):353-368. doi: 10.1038/s41374-020-00512-2. Epub 2020 Dec 12. PMID: 33311557; PMCID: PMC7892342.

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