肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因，在組織學上分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC），NSCLC 進一步細分為腺癌（ADC）、鱗狀細胞癌（SCC）和其他不太常見的亞型，例如大細胞癌（LCC）。腫瘤相關成纖維細胞（TAFs），是基質細胞類型，研究表明，非小細胞肺癌中的 TAFs 根據其來源腫瘤的組織學亞型表現出不同的表型改變，這表明TAFs促進腫瘤進展的機制可能與癌癥亞型有關。

在TAFs 中，獲得的衰老表型正在成為主要的腫瘤促進過程。衰老細胞還可以表現出促炎因子和其他可溶性因子的分泌增加，稱為衰老相關分泌表型（SASP）。值得注意的是，已經在幾種實體瘤中發現了衰老的 TAFs，其中侵襲性腫瘤進展與衰老 TAFs 的 SASP 有關。LCC 腫瘤通常表現出侵襲性腫瘤表型，從 LCC 患者中分離出來的 TAFs 更有可能衰老，這表明 LCC-TAFs 的衰老可能與 LCC 腫瘤的侵襲性和增殖性特征增強有關。

西班牙巴塞羅那大學醫學與健康科學學院、美國梅奧診所癌癥生物學系、意大利IRCCS國家腫瘤研究所等研究團隊的一項工作發現，基質金屬蛋白酶-1（MMP1）是成纖維細胞旁分泌衰老的關鍵 LCC 分泌因子，并隨后增強腫瘤促進特性。這些結果確立了 MMP1 在癌癥中的全新作用，并在LCC進展中定義了致瘤性衰老成纖維細胞的 MMP1 依賴性旁分泌激活的新模式。此外，基于靶向衰老的成纖維細胞確定了一種針對這種知之甚少的癌癥類型的新治療策略。

MMP1 在 LCC 細胞系中選擇性過表達，是衰老成纖維細胞旁分泌誘導所必需的

為了確定 LCC 細胞分泌的誘導共培養成纖維細胞衰老的因子，實驗評估了一組隨機選擇的培養 LCC（H460、H661）和非 LCC 細胞系（ADC 和 SCC：H1437、 H358、H1703、A549 和 H23）。通過 qRT-PCR 證實，H460 和 H661 LCC 細胞中的MMP1過表達。

為了評估 LCC 細胞表達MMP1是否是誘導共培養的成纖維細胞衰老所必需的，使用兩種不同的質粒通過 shRNA 敲低了三種 LCC 細胞系（H460、H1299 和 H661）中的MMP1表達，Scr 是用作對照，并分析了三種標準衰老標志物：衰老相關的β-半乳糖苷酶（SA-βgal）的誘導、性生長停滯和細胞周期抑制劑CDKN2A（p16 INK4a）在與MMP1表達減少的LCC系共培養的成纖維細胞中的表達。最終發現表明，MMP1在 LCC 細胞中的表達是成纖維細胞衰老的旁分泌誘導的原因。

LCC 細胞中的 MMP1 敲低消除了共培養的成纖維細胞的促腫瘤作用，并損害了體內腫瘤的生長

之前表明，來自與 LCC 細胞系共培養的成纖維細胞的條件培養基（CM）可增強 LCC 細胞的生長和侵襲。在這里，實驗發現當使用來自與 shMMP1 LCC 細胞（H460、H1299）共培養的成纖維細胞的 CM 時，這種效果會大大減弱（圖1 A-D），并且在與 H661 細胞的共培養中發現了類似的結果。

細胞因子IL6和IL8被認為是衰老細胞分泌組或 SASP的關鍵元素，并且在與感染對照（Scr）慢病毒的 H460 和 H1299 細胞共培養的成纖維細胞中，IL6和IL8在 mRNA 水平和作為分泌蛋白顯著上調（圖1 E-H），與衰老表型一致。然而，這種上調隨著 H460 細胞的 MMP1 的敲低而顯著減弱（圖1 E、G），但在H1299（圖1 F、H）或H661細胞系中效果不很明顯，表明通過與表達MMP1的LCC細胞共培養增強的衰老成纖維細胞的促腫瘤特性與除IL6和IL8之外的SASP因子相關。

接下來，在帶有 MMP1 敲低的 H460 細胞的腫瘤異種移植物中，LCC 細胞的MMP1 mRNA 仍顯著下調。與體外研究結果一致，與親本細胞相比，發現在攜帶 shMMP1 細胞的腫瘤中腫瘤生長和腫瘤吸收顯著減少。此外還觀察到，與對照 H460 細胞相比，來自 shMMP1 H460 細胞的腫瘤表現出更少的衰老成纖維細胞。這些觀察結果強烈支持，LCC 細胞中的MMP1是促腫瘤的衰老成纖維細胞異常積累所必需的。

圖2   LCC細胞中MMP1在培養的成纖維細胞促腫瘤作用中的效應。

重組 MMP1（rMMP1）在共培養中部分挽救成纖維細胞衰老及其增強的促腫瘤特性

實驗接下來評估了MMP1是否足以誘導成纖維細胞衰老和/或增強衰老成纖維細胞分泌組的促腫瘤特性。對照成纖維細胞使用 45 U/ml 活性 rMMP1 暴露 7 天并沒有顯著增加 SA-βgal+ 成纖維細胞的比例（圖2 A）或 SASP 標志物IL6和IL8的 mRNA 表達（圖2 B、C）。一致地，單獨用 rMMP1 處理的成纖維細胞的 CM 并沒有增加 H460（圖2 D、F）或 H1299（圖2 E、G）的生長和侵襲，甚至降低了 H460 的侵襲。然而，將 45 U/ml rMMP1 添加到與 shMMP1 H460 或 H1299 細胞共培養的對照成纖維細胞的培養基中（圖2 H）顯著增加了 SA-βgal 陽性（圖2 I、J）。補充 rMMP1 也挽救了 shMMP1 H460 或 H1299 誘導共培養成纖維細胞 CM 的生長和侵襲促進作用的能力（圖2 K-N）。這些結果表明，單獨的 rMMP1 不足以誘導成纖維細胞衰老或增強其 CM 的促腫瘤特性，并支持了它需要輔因子。

圖2   重組 MMP1（rMMP）對成纖維細胞衰老和促腫瘤性狀的影響。

結合 rMMP1 和 TGF-β1 足以誘導成纖維細胞衰老和促腫瘤作用

因為來自 LCC 患者的 TAFs 表現出激活/肌成纖維細胞樣表型，而 TGF-β1 是一種已知的成纖維細胞激活劑，在 NSCLC 中經常上調，并且與衰老有關，實驗檢查了rMMP1與TGF-β1組合對對照肺成纖維細胞的影響。最終觀察結果揭示了MMP1 和 TGF-β1 之間的一種新的相互作用，它引發了成纖維細胞衰老，同時增強了它們在 LCC 細胞上的分泌組的促腫瘤特性。

為了進一步說明 TGF-β1 在 LCC 誘導的成纖維細胞衰老中的作用，首先在 Sanger 數據庫中的一組擴展細胞系中檢測了TGFB1 mRNA ，發現與非 LCC 系相比，LCC 中TGF-β1 顯著上調。接下來，使用 CAGA 報告基因在共培養實驗中檢查了分泌的 TGF-β1 的生物活性，發現與裸對照相比，與 H460 LCC 細胞共培養的成纖維細胞顯著增加，同時伴隨成纖維細胞活化標志物COL1A1和α-SMA的表達增加。這些結果強烈支持在 LCC 細胞中選擇性地存在異常大的 TGF-β1 表達。

氧化應激和 F2R（PAR-1）參與了 rMMP1 和 TGF-β1 在成纖維細胞中的促衰老和促腫瘤作用

為了開始揭示由 rMMP1 和 TGF-β1 共同刺激引起的成纖維細胞衰老的機制，實驗使用了三種互補策略，其中檢查了氧化應激的作用。首先通過 SA-βgal+ 細胞（圖3 A）和 SASP 因子IL6和IL8的表達（圖3 B、C），證實 NAC 在與 H460 共培養時減弱了成纖維細胞衰老。此外，發現 NAC 顯著減弱了由 rMMP1 和 TGF-β1 共同刺激引起的 SA-βgal+ 成纖維細胞的增加（圖3 D），相應的 CM 顯著降低了H460 細胞的生長（圖3 E）和侵襲（圖3 F），表明氧化應激在 LCC 誘導的成纖維細胞衰老和隨后的促腫瘤分泌組激活中都有作用。

最后分析了蛋白酶激活受體 PAR-1 的作用，它是一種 G 蛋白偶聯受體，先前參與了由F2R基因編碼的基質細胞中MMP1下游的信號轉導。有趣的是，通過與 rMMP1 和 TGF-β1 共刺激或與 H460 細胞共培養來誘導成纖維細胞衰老，始終下調F2R（PAR-1）mRNA（圖3 G) 和相應的蛋白質表達（圖3 H），而這種下調在與 shMMP1 H460 細胞共培養時被消除（圖3 I）。同樣，通過 siRNA 迫使對照成纖維細胞中的F2R下調（圖3 J），與 siControl相比（圖3 K），在與H460細胞共培養時，SA-βgal+成纖維細胞的表達增加類似（圖3 K），甚至衰老標志物IL6和IL8的表達量也更高（圖3 L、M），暗示更強的衰老表型。這些結果強烈支持在 rMMP1 和 TGF-β1 下游引起的F2R下調可能與它們對成纖維細胞衰老的誘導有關。圖3 N總結了所有這些機制的見解。

圖3   成纖維細胞中由rMMP1和TGF-β1引起的促衰老和促腫瘤作用的機制研究。

總之，該研究結果支持 LCC 細胞通過 MMP1 和 TGF-β1 的異常分泌引發腫瘤支持生態位，從而誘導相鄰成纖維細胞衰老。衰老 TAFs 的這種異常增加可能至少部分是 LCC 侵襲性的基礎，因為衰老成纖維細胞增強了 LCC 細胞的生長和侵襲，超出了非衰老成纖維細胞引起的范圍，因此，在未來對這種罕見疾病的研究中測試抗衰老藥物的可能性令人興奮。

參考文獻：Gabasa M, Radisky ES, Ikemori R, Bertolini G, Arshakyan M, Hockla A, Duch P, Rondinone O, Llorente A, Maqueda M, Davalos A, Gavilán E, Perera A, Ramírez J, Gascón P, Reguart N, Roz L, Radisky DC, Alcaraz J. MMP1 drives tumor progression in large cell carcinoma of the lung through fibroblast senescence. Cancer Lett. 2021 Jun 1;507:1-12. doi: 10.1016/j.canlet.2021.01.028. Epub 2021 Mar 6. PMID: 33684534; PMCID: PMC8026696.

小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。

微信搜索公眾號“Naturethink"，了解更多細胞體外仿生培養技術及應用！