成纖維細胞是間充質基質中常見的貼壁細胞類型。成纖維細胞和間充質干細胞具有相似的 MSC 標記，可以分化成成骨、脂肪和軟骨細胞譜系。成纖維細胞和間充質干細胞的相似性支持使用成纖維細胞作為研究成骨的合適細胞類型。當干細胞處于由生物材料、生長因子和組織組成的微環境中時，適當的機械刺激可以促進干細胞的成骨分化。臨床和基礎研究表明，外部機械刺激，例如因拉伸而增加的張力，可以影響干細胞的成骨分化。機械轉導通常通過整合素將機械刺激轉化為生化信號，然后影響下游細胞活動的過程。

整合素是存在于細胞表面的跨膜受體，是由非共價鍵連接的α和β亞基組成的功能性異二聚體。整合素的聚集和激活募集和激活細胞內信號蛋白，如粘著斑激酶（FAK）、紐蛋白和踝蛋白，它們有助于粘著斑并影響干細胞的分化。

Yes 相關蛋白（YAP）是一種轉錄共激活因子，通過與可控制轉錄的 TEAD（TEA 結構域 DNA 結合轉錄因子家族）DNA 結合蛋白結合，促進細胞增殖并調節干細胞分化。研究表明，通過敲除肌動蛋白細胞骨架的調節因子或用 F-肌動蛋白抑制藥物處理來控制 F-肌動蛋白水平會顯著影響 YAP 活性。然而，機械刺激如何通過整合素-微絲軸影響 YAP 以調節干細胞成骨分化仍不清楚。

廣東省醫學生物力學重點實驗室、廣州醫科大學第一附屬醫院眼科的課題組曾研究了整合素αVβ3與循環拉伸應力（CTS）誘導的早期成骨分化之間的關系。整合素αVβ3的激活導致肌動蛋白絲重排并調節核YAP的表達。此外還發現FAK參與了粘著斑的形成，整合素αVβ3介導的FAK磷酸化在CTS誘導的成骨分化早期發揮了作用。該研究表明整合素αVβ3可作為骨修復的治療靶點。

循環拉伸應力促進成纖維細胞中的細胞增殖和成骨

研究探討了循環拉伸應力（0.5 Hz，10%）、細胞增殖和成纖維細胞成骨分化之間的關系。首先，成纖維細胞暴露于循環拉伸應力 4 天和 7 天。如圖1 a，成纖維細胞增殖響應于循環拉伸應力而增加。作為成骨分化標志物的 ALP 和 RUNX2 的蛋白質和 RNA 表達在循環拉伸應力下 7 天后增加（圖1 c、d）。成纖維細胞的 ALP 染色也獲得了類似的結果，在循環拉伸應力下ALP 染色更高（圖1 b）。這些結果表明，循環拉伸應力促進了成纖維細胞的細胞增殖和早期成骨分化。

圖1   CTS下成纖維細胞中細胞增殖、早期成骨分化和整合素αVβ3的表達。

（a）細胞增殖在 CTS 下 1 天、4 天、7 天。（b ）ALP 染色在CTS 下 4 天和 7 天。（c）ALP和RUNX2蛋白表達在CTS下4天和7天。（d ）ALP和RUNX2 mRNA表達在CTS下4天和7天。（e）整合素αVβ3 mRNA表達在CTS下4天和7天。（f）整合素 αVβ3 的免疫熒光在 CTS 下 7 天。

循環拉伸應力誘導的早期成骨分化依賴于整合素αVβ3的表達和激活

為了探索整合素是否參與循環拉伸應力誘導的成骨分化和細胞增殖，通過qRT-PCR和免疫熒光分析了整合素αVβ3在成纖維細胞中的表達。實驗發現整合素αVβ3的表達在循環拉伸應力下增加（圖1 e、f），表明循環拉伸應力促進整合素αVβ3的表達。因此，研究了循環拉伸應力下整合素αVβ3與成骨分化之間的關聯。為了確定循環拉伸應力是否以整合素αVβ3依賴性方式刺激成骨分化，整合素αVβ3的功能被整合素αVβ3的拮抗劑shRNA或RGDyk抑制。如圖2 a，當成纖維細胞中整合素αV或β3的表達下調時，循環拉伸應力下細胞增殖減少。

然后，通過 ALP 染色、蛋白質印跡和 qRT-PCR 檢測整合素 αVβ3 對成骨分化的影響。shRNA-整合素αV和β3組的ALP染色比CTS組少（圖2 b）。蛋白質印跡顯示，在成纖維細胞中整合素αVβ3表達下調后，ALP和RUNX2的蛋白質表達降低（圖2 c、e）。通過 qRT-PCR 獲得了類似的結果，當整合素 αVβ3 表達被抑制時，ALP 和 RUNX2 mRNA 的表達降低（圖2 d、f）。這些結果表明，循環拉伸應力通過整合素αVβ3促進成纖維細胞的早期成骨分化和細胞增殖。

圖2   CTS 通過整合素 αVβ3 調節細胞增殖和早期成纖維細胞成骨分化。

（a）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的細胞增殖。（b）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下的ALP染色。（c）在 GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的蛋白質表達。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達。（e）在 CTS 下GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的蛋白質表達。（f） CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 ALP 和 RUNX2 的 mRNA 表達

成骨過程中通過整合素αVβ3調節循環拉伸應力的肌動蛋白絲

為了更好地了解循環拉伸應力下整合素αVβ3與肌動蛋白絲之間的關聯，實驗檢測了整合素αVβ3被抑制時β-肌動蛋白的表達。蛋白質印跡和qRT-PCR顯示β-肌動蛋白的表達在循環拉伸應力下增加。當整合素 αVβ3 的表達受到抑制時，RGDyk 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。還發現 shRNA-整合素 αV 或 β3 組中 β-肌動蛋白的表達低于 CTS 組。免疫熒光顯示，微絲應力纖維在循環拉應力作用下呈網狀分散在靠近細胞膜的結構中。當整合素αVβ3的表達受到抑制時，微絲應力纖維以與GM（培養基）組相似的拉長方式排列。這些結果表明，循環拉伸應力上調β-肌動蛋白的表達并通過整合素αVβ3改變肌動蛋白絲的結構。

為了研究肌動蛋白絲是否參與由循環拉伸應力誘導的成骨分化，使用細胞松弛素D 來抑制肌動蛋白絲的聚合。蛋白質印跡顯示，在循環拉伸應力下，細胞松弛素D降低了ALP和RUNX2的表達。這些結果表明，循環拉伸應力通過整合素αVβ3-微絲軸調節成纖維細胞成骨分化的早期階段。

成骨過程中通過整合素αVβ3-微絲軸調節循環拉伸應力核YAP

實驗還探討了循環拉伸應力是否通過整合素αVβ3-微絲軸調節核 YAP 的表達。蛋白質印跡和qRT-PCR顯示核YAP的表達在循環拉伸應力下增加。當整合素αVβ3的表達受到抑制時，蛋白質印跡顯示核YAP的表達低于CTS組。免疫熒光結果顯示，在循環拉應力作用下，核YAP的表達明顯增加。此外還發現，當整合素 αVβ3 被抑制時，核 YAP 的表達降低。這些結果表明，循環拉伸應力通過整合素αVβ3上調核YAP。

當細胞松弛素D 抑制 β-肌動蛋白的聚合時，蛋白質印跡和免疫熒光顯示核 YAP 的表達在循環拉伸應力下降低。蛋白質印跡還顯示，在維替泊芬存在下，在循環拉伸應力下ALP和RUNX2的表達降低。上述實驗表明，在成骨分化早期，循環拉伸應力通過整合素αVβ3-微絲軸調節核YAP。

循環拉伸應力促進成骨過程中粘著斑的形成和 FAK 磷酸化

由肌動蛋白絲和整合素形成的粘著斑需要踝蛋白（talin）、FAK 和紐蛋白（vinculin）才能將 CTS 傳遞到基底。實驗檢測了 talin-1、FAK 和 vinculin 的表達，以探索它們與整合素 αVβ3 的關聯。蛋白質印跡和qRT-PCR顯示在循環拉伸應力下talin-1、FAK和vinculin的表達增加（圖3 a、b）。蛋白質印跡顯示，當整合素αVβ3的表達被c（RGDyk）或shRNA抑制時，talin-1，FAK和vinculin的表達降低（圖3 c、e）。qRT-PCR 獲得了類似的結果（圖3 d、f）。免疫熒光顯示，紐蛋白在循環拉伸應力下的可見粘著斑斑塊中表達和定位更高。整合素αVβ3的抑制與紐蛋白表達的顯著降低相關（圖3 g）。這些結果表明，循環拉伸應力通過整合素αVβ3促進粘著斑的形成。

接下來，研究了 FAK 磷酸化在循環拉伸應力下在成骨分化中的作用。蛋白質印跡顯示FAK的磷酸化響應于循環拉伸應力而增加，并且整合素αVβ3的抑制下調了FAK的磷酸化（圖3 h、i）。實驗發現，當 FAK 的磷酸化被 Y-15（一種小分子抑制劑）抑制時，ALP 和 RUNX2 的表達降低（圖3 j）。這些結果表明，FAK不僅參與了含有整合素αVβ3的粘著斑的形成，而且FAK的磷酸化有助于循環拉伸應力誘導的成骨分化的早期階段。

圖3   CTS 誘導的整合素 αVβ3 激活調節粘著斑相關蛋白和 FAK 的磷酸化，以促進成骨分化的早期階段。

（a）talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質表達在 CTS 下 4 天和 7 天。（b）talin-1、FAK和vinculin mRNA表達在CTS下4天和7天。（c）GM 和 RGDyk 組中 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質表達。（d）GM 和 RGDyk 組在 CTS 下 talin-1、FAK 和 vinculin 的 mRNA 表達。（e）在 CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 talin-1、FAK 和 vinculin 的蛋白質表達。（f）GM、NC、shRNA-整合素αV和shRNA-整合素β3組在CTS下talin-1、FAK和vinculin的mRNA表達。（g） GM、CTS、NC、shRNA-integrin αV 和 shRNA-integrin β3 組在 CTS 下的 vinculin 免疫熒光 7 天。（h） CTS 下 FAK 磷酸化水平 7 天。（i）CTS 下 GM、NC、shRNA-整合素 αV 和 shRNA-整合素 β3 組中 FAK 的磷酸化水平。（j）CTS下CTS組和Y15組ALP和RUNX2蛋白表達。

循環拉伸應力通過整合素αVβ3的激活對成纖維細胞早期成骨分化產生積極影響，導致微絲細胞骨架的重排。此外，循環拉伸應力刺激的肌動蛋白絲的重排和 FAK 的磷酸化通過整合素 αVβ3 導致人成纖維細胞中核 YAP 的表達增加。在未來的研究中，整合素αVβ3應該被認為是體內實驗的一個有希望的靶點，以驗證其促進骨修復的功能。

參考文獻：Peng Y, Qu R, Feng Y, Huang X, Yang Y, Fan T, Sun B, Khan AU, Wu S, Dai J, Ouyang J. Regulation of the integrin αVβ3- actin filaments axis in early osteogenesis of human fibroblasts under cyclic tensile stress. Stem Cell Res Ther. 2021 Oct 7;12(1):523. doi: 10.1186/s13287-021-02597-y. PMID: 34620239; PMCID: PMC8496073.

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