檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 10 管/9 樣

測(cè)定意義：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)*個(gè)限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點(diǎn)之一。

測(cè)定原理：

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶 A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無(wú)色的 DTNB 轉(zhuǎn)變成黃色 TNB，在 412nm 處有特征吸光值。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體 10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：液體 2mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 0.2mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1 支，4℃保存，臨用前加入 320μL 蒸餾水，用不完的試劑仍 4℃保存；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 320μL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑七：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 320μL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。 
2. 將勻漿 600g，4℃離心 5min。 
3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。 
4. 上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 CS（此步可選做）。 
5. 在步驟④中的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 CS 測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑四、五、六和七在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min。

3、樣本測(cè)定

將上述試劑按順序加入 1 mL 玻璃比色皿中，加試劑七的同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，在 412nm 波長(zhǎng)下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和反應(yīng) 2min 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

CS 活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

 單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（U/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CS（U/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.4444×ΔA V 反總：反應(yīng)體系總體積，9×10^-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。