乳酸脫氫酶活力測定

目的要求

1、了解乳酸脫氫酶活性測定原理

2、學(xué)習(xí)用別色法測定酶活性的方法

實驗原理

    乳酸脫氫酶廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)，是糖代謝酵解途徑的關(guān)鍵之一。

    LDH可溶于水或稀鹽溶液。組織中LDH含量測定方法很多，其中紫外分光光度更為簡單、快速。鑒于NADH、NAD+在340nm及260nm處有各自的zui大吸收峰，因此以NAD+為捕酶的各種脫氫酶類都可通過340nm光吸收值的改變，定量測定酶活力，如蘋果酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、甘油-3-3磷酸脫氫酶等。

    本實驗測乳酸脫氫酶活力，是在一定條件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脫氫酶提取液，觀察NADH在反應(yīng)過程中340nm處光吸收減少值，減少越多，則LDH活力越高。其活力單位定義是：在25℃，pH7.5條件下每分鐘A340下降值為1.0的酶量為1個單位。

試劑和器材

1、試劑

50mmol/L，pH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液母液：

溶液A，50mmol/L，k2HPO4：稱K2HPO4，1.74g加蒸餾水溶解后定容至200mL。

溶液B，50mmol/L，KH2PO4：稱KH2PO4，3.40g加入蒸餾水溶解后定溶至500mL。

取溶液A31.5mL+溶液B68.5mL，調(diào)節(jié)pH至6.5.置4℃冰箱備用。

10mmol/L  pH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液用上述母液稀釋得到。現(xiàn)用現(xiàn)配。

0.2mol/L  pH7.5磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液母液：

溶液A，0.2mol/L，Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O，71.64g加蒸餾水溶解后定容至1000mL。

溶液B，0.2mol/L， NaH2PO4：NaH2PO4·2H2O，31.21g加蒸餾水溶解后定容至1000mL。

取溶液A84mL+溶液B16mL，調(diào)節(jié)pH至7.5.置4℃冰箱備用。

0.1mol/L，pH7.5磷酸鹽緩沖液，用上述母液稀釋得到。現(xiàn)用現(xiàn)配。

NADH溶液：稱3.5mg純NADH置試管中，加0.1mol/L,pH7.5磷酸緩沖液1mL，搖勻。現(xiàn)用現(xiàn)配。

丙酮酸溶液：稱2.5mg丙酮酸鈉，加0.1mol/L，pH7.5磷酸緩沖液29mL，使其*溶解。現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、材料

兔肉。

3、器材

組織搗碎機(jī)；移液管5mL（×2），0.1mL（×2）；微量注射器10uL（×1）；恒溫水浴。分光光度計。

操作方法

1、制備肌肉勻漿

    稱取20g兔肉，按W/V=1/4比例加入4℃預(yù)冷的10nmol/L，pH6.5磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，用組織搗碎機(jī)搗碎，每次10s，連續(xù)3次。將勻漿液倒入燒杯中，置4℃冰箱中提取過液，過濾后得到組織提取液。

2、LDH活力了測定

    預(yù)先將丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中預(yù)熱。取2只石英比色杯，在1只比色杯中加入0.1mol/L，pH7.5磷酸鹽緩沖液3mL，置于紫外分光光度計中，在340nm處將光吸收調(diào)節(jié)至零。另一只比色杯用于測定LDH活力，依次加入丙酮酸鈉溶液2.9mL，NADH溶液0.1mL，加蓋搖勻后，測定340nm光吸收值（A）。取出比色杯加入經(jīng)稀釋的酶液10uL，立即即時，搖勻后，每隔0.2min測A340，連續(xù)測定3min，以A對時間作圖，取反應(yīng)zui初線性部分，計算每分鐘A340減少值。加入酶液的稀釋度應(yīng)控制每分鐘A340下降值在0.1～0.2之間。

注意事項

1、實驗材料應(yīng)盡量新鮮，如取材后不立即用，則應(yīng)貯存在零下20攝氏度冰箱。

2、酶液的稀釋度及加入量應(yīng)控制每分鐘A340下降值在0.1～0.2之間，以減少實驗誤差。

3、NADH溶液應(yīng)在臨用前配制。