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引言

在細胞和組織培養(yǎng)領域，從上世紀70年代起2維（2D）培養(yǎng)的局限性和3維（3D）培養(yǎng)的優(yōu)點引來諸多關注，越來越多的研究希望將細胞從平面環(huán)境中轉(zhuǎn)變到3D空間來。當前，雖然對基于細胞的效應研究和毒性測試中，制藥工業(yè)如今zui常用的依舊是2D方式，3D培養(yǎng)技術(shù)已在學術(shù)研究中被廣泛應用。隨著在生物相關性，通量，產(chǎn)出量等方面的改進，伴隨3D培養(yǎng)成本的降低，3D培養(yǎng)在再生醫(yī)學，基礎研究和藥物研發(fā)中的應用將越來越廣泛，一場細胞由2D培養(yǎng)走向3D的變革正在發(fā)生。

2D細胞培養(yǎng)的局限性與3D培養(yǎng)的優(yōu)勢

細胞增殖，分化和代謝等生理活動都嚴重受到微環(huán)境的影響。當前細胞生物學研究大多還是在二維平面培養(yǎng)進行，這種平面培養(yǎng)、生長方式與機體內(nèi)立體環(huán)境差別很大，導致細胞形態(tài)、分化、細胞與基質(zhì)間的相互作用以及細胞與細胞間的相互作用與體內(nèi)生理條件下細胞的行為存在明顯差異。2D和3D環(huán)境下培養(yǎng)的細胞相比較，諸多生理指標都顯著不同，例如原代小鼠乳腺管腔上皮細胞(mammary luminal epithelial cells, MEC)在3D基底膜基質(zhì)中增殖的時間明顯長于2D培養(yǎng)環(huán)境；更有甚者，有時藥物作用于2D培養(yǎng)的細胞呈現(xiàn)的效應與3D細胞相反。3D培養(yǎng)可以設計模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，讓細胞在生理行為上與機體實際的生理環(huán)境更接近。正因為此，很多藥物研發(fā)企業(yè)和護膚品生產(chǎn)企業(yè)更傾向于使用3D培養(yǎng)細胞（或組織類似物）來開展實驗、研究：3D培養(yǎng)讓藥物研發(fā)企業(yè)相當程度上擺脫了倫理3R對動物實驗的約束，縮短了研發(fā)周期，提高了結(jié)果可信度，研發(fā)少走了彎路，從而節(jié)省了成本，提高了企業(yè)的競爭力。可以預見，未來在高通量，自動化，低成本，廣應用性和高預測性等方面3D培養(yǎng)將逐步突破并日趨成熟、完善，2D培養(yǎng)向3D的轉(zhuǎn)變成為必然的發(fā)展趨勢和時代潮流。

3D細胞培養(yǎng)的主要類型

當前市場上有多種類型的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，根據(jù)產(chǎn)品是否為細胞提供支撐（支架）材料（scaffold）大體可分為兩種類型：基于scaffold的培養(yǎng)體系和無scaffold的培養(yǎng)體系。Scaffold則又有天然成分和人工合成成分之分。

一、無scaffold的培養(yǎng)體系

沒有供細胞粘附、生長和擴散的支撐結(jié)構(gòu)，使培養(yǎng)基中的細胞聚集成為類似于組織的微組織球體（microtissue spheroids）。無scaffold的培養(yǎng)體系可通過懸滴（hanging drops）讓細胞在重力的作用下通過自組裝形成微球體。這種方法的優(yōu)點是可以通過控制懸滴而的控制微組織球，使其具有高一致性，為后續(xù)研究提供好的微組織材料。而且通過懸滴法可以實現(xiàn)對不同細胞類型的共培養(yǎng)，保證共培養(yǎng)細胞間的信息交流。

無scaffold的培養(yǎng)懸滴培養(yǎng)體系的代表性廠家為InSphero，他們的96孔板設計可以通過手動操作，也支持自動化上樣裝置輕松實現(xiàn)微組織培養(yǎng)，在腫瘤研究和新型抗癌藥物篩選等領域中被廣泛選用。

下面對InSphero的懸滴培養(yǎng)技術(shù)做一簡要介紹：

InSphero技術(shù)生產(chǎn)的GravityPLUS™板使懸滴細胞培養(yǎng)變得異常簡單。只需用液體處理裝置(liquid handling device)—手動吸管或自動化96孔上樣機器手，在上端添加50μL細胞懸液即可。長時間培養(yǎng)或是分化研究時，可以移走多達70%的舊培基，然后在上端加入新培基。微組織形成后就可以使用一次簡單的培基添加步驟將微組織收入GravityTRAP™板中。GravityTRAP™板專有的非粘附包被技術(shù)可使微組織在無依附、不解聚情況下培養(yǎng)數(shù)星期。另外，其*的設計能保證在不擾動微組織情況下實現(xiàn)培基更換、并可直接通過培養(yǎng)孔板下方實現(xiàn)成像分析（例如高內(nèi)涵分析, high-content analysis）。

更多關于InSphero產(chǎn)品的介紹請參考如下鏈接：

http://www.qbiotec.com/qxky001-Products-18502066/

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370101m2vs.html

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370101m2vv.html

其它無scaffold產(chǎn)品還有：3D Biomatrix公司的Perfecta3D懸滴板通過懸滴技術(shù)實現(xiàn)微組織培養(yǎng)。Nano3D Biosciences公司的Bio-Assembler采用磁懸浮技術(shù)，通過將細胞磁化，使其在磁場中懸浮實現(xiàn)3D培養(yǎng)。InfiniteBio公司SCIVAX 3D產(chǎn)品，其NanoCulture Plate (NCP)為合成聚合物(synthetic polymer)材料，具有超低粘附力的微板結(jié)構(gòu)表面，細胞在此微結(jié)構(gòu)上遷徙、相互粘附形成微球體。BioLevitator應用磁性微球載體，整合3D和微載體培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)高密度3D細胞培養(yǎng)；microtissues的3D petri Dish通過瓊脂界面進行3D培養(yǎng)等。

二、基于scaffold的培養(yǎng)體系

1. 根據(jù)支持物的性質(zhì)分類，基于scaffold的培養(yǎng)體系可分為天然細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）作為支持材料的3D培養(yǎng)和人造基質(zhì)作為支持材料的3D培養(yǎng)。

（1）天然ECM作為支持材料的3D培養(yǎng)

這種方法以天然ECM作為支持材料，根據(jù)培養(yǎng)細胞類型，優(yōu)化3D培養(yǎng)基質(zhì)配方，以滿足不同組織細胞的培養(yǎng)需求。很多公司都可提供細胞外基質(zhì)產(chǎn)品用于3D培養(yǎng)，例如TAP Biosystems（已被Sartorius Stedim Biotech收購）的RAFT膠原系統(tǒng)，Matrigel模擬基底膜基質(zhì)產(chǎn)品；Advanced BioMatrix，Amsbio和Sigma-Aldrich公司也都有細胞外基質(zhì)凝膠產(chǎn)品。但天然基質(zhì)材料存在一定病原風險，且材料可能存在批次差別性等缺點。

（2）人造基質(zhì)作為支持材料的3D培養(yǎng)方法

合成的人造基質(zhì)材料類型相當多，例如Cellendes的3D Life仿生水凝膠材料；3D Biotek公司有多種3D大分子支架材料；Reinnervate公司Alvetex產(chǎn)品用的是聚苯乙烯(polystyrene scaffold)；Life Tech公司的AlgiMatrix 3D培養(yǎng)系統(tǒng)采用褐藻原料；Synthecon和Xanofi的納米纖維技術(shù)平臺XanoMatrix采用合成納米生物基質(zhì)和培養(yǎng)材料；PuraMatrix采用合成肽水凝膠；其它合成材料產(chǎn)品還包括Lena Biosciences的SeedEZ等。

Cellendes的3D Life仿生水凝膠材料可以說是合成的人造基質(zhì)材料的代表。Cellendes的3D Life仿生水凝膠通過合成大分子材料和交聯(lián)劑(crosslinker)方式和比例的靈活組合，構(gòu)建不同的3D細胞培養(yǎng)環(huán)境。這種高化學和機械柔性（flexibility）的合成系統(tǒng)賦予了該材料較動物源性支持材料更多的優(yōu)勢。諸多優(yōu)點使3D Life仿生水凝膠不但是普通3D培養(yǎng)的上佳選項，也使其成為細胞擴散和遷移研究的理想產(chǎn)品。

下文對Cellendes的3D Life Biomimetic Hydrogel System做一簡單介紹：

3D life仿生水凝膠系統(tǒng)與活體細胞外基質(zhì)類似，可使體外細胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征，是基礎研究、藥物篩選和再生醫(yī)學等領域的理想選擇。這類產(chǎn)品的優(yōu)點主要體現(xiàn)在如下三個方面：A)產(chǎn)品組合靈活。B)操作簡單，控制自如。C)應用范圍廣泛：可用于細胞培養(yǎng)、標記和顯微觀察等諸多方面；細胞可在凝膠內(nèi)也可在凝膠表面培養(yǎng)；可活細胞直接觀察也可選擇原位固定后觀察；支持GFP等多種報告基因標記后觀察方式；可選擇不同類型細胞共培養(yǎng)，更好模擬體內(nèi)生理狀態(tài)。

3D life主要有兩種水凝膠：PEG-Link交聯(lián)形成的水凝膠和CD-Link交聯(lián)形成的水凝膠：

細胞在PEG-Link交聯(lián)形成的水凝膠中培養(yǎng)

細胞可以通過單細胞或是細胞團的形式埋在PEG-Link為交聯(lián)劑的水凝膠中，根據(jù)細胞類型不同，形成上皮樣囊結(jié)構(gòu)，微球體或是克隆。可以根據(jù)需要考慮為生成特定的表型而添加相應的細胞粘附因子。細胞不能在這種水凝膠中遷移擴散。

細胞在CD-Link交聯(lián)形成的水凝膠中培養(yǎng)

細胞可以通過單細胞或是細胞團的形式埋在CD-Link為交聯(lián)劑的水凝膠中，培養(yǎng)的細胞如產(chǎn)生相應的細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶則能將臨近的基質(zhì)交聯(lián)劑切割。在添加相應粘附因子基序下，細胞誘導細胞擴散和遷移。

3D life水凝膠中細胞的固定與標記

使用小分子物質(zhì)，例如熒光標記phalloidin，核酸染料，活性和毒性檢測試劑，增值檢測試劑等小分子物質(zhì)進行細胞標記方法，除了在孵育時間上適度延長以便能在水凝膠中充分擴散外，與傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)方式相同。所培養(yǎng)的細胞如果經(jīng)基因修飾還有熒光蛋白，則可直接用于觀測，因凝膠*透明不影響觀測結(jié)果。如果使用抗體等大分子對細胞進行標記則不能直接在水凝膠中開展，因水凝膠的孔徑原因，不適合直接抗體標記，需要使用dextranase將細胞從水凝膠中釋放出來，如果擔心細胞在操作過程中細胞生理活動波動，則可經(jīng)在凝膠中將細胞固定后在進行操作。

更多關于Cellendes產(chǎn)品的介紹可參考如下鏈接：

http://www.qbiotec.com/qxky001-Products-18500597/

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370102v7kc.html

2. 如果按支持材料形成的方式分，基于scaffold的培養(yǎng)體系可分為如下兩類，一種是將細胞分散在液體水凝膠中，然后通過交聯(lián)實現(xiàn)3D培養(yǎng)，這類產(chǎn)品代表生產(chǎn)商包括Cellendes, Matrigel, Glycosan Biosystems和QGel等；另外一種是將細胞“播種"在3D基質(zhì)上，這類方法的代表廠商包括3D Biotek, Alvetex和AlgiMatrix等。*種方式中的Cellendes產(chǎn)品上面已經(jīng)做了簡要介紹；下面將細胞“播種"在3D基質(zhì)方法的代表產(chǎn)品3D Biotek給予簡要介紹：

3D Biotek得益于其精妙的3D微細加工技術(shù)和先進的生物制造工藝，產(chǎn)品在干細胞/組織工程、藥物研發(fā)和細胞生物應用等涉及3D培養(yǎng)的領域處于地位。

根據(jù)用戶的不同需求，3D Biotek提供系列的產(chǎn)品和裝置，包括多種3D細胞培養(yǎng)的支架材料：例如可生物降解的聚已內(nèi)酯3D Insert PCL，這種材料已經(jīng)被美國標準和技術(shù)協(xié)會(NIST)認定為標準的3D組織培養(yǎng)支架材料；聚苯乙烯3D Insert PS材料。

3D Biotek開發(fā)有*的可直接用于如細胞凋亡和熒光ELISA等熒光和化學發(fā)光實驗的新材料培養(yǎng)板。

3D Biotek還提供可降解生物材料Poly(DL-lactide-co-glycolide) (PDLLGA)。

3D Biotek有用于3D腫瘤細胞或干細胞培養(yǎng)(或共培養(yǎng))的仿生基底膜：3D Insert-PS/PCL (聚苯乙烯/聚已內(nèi)酯)納米篩網(wǎng)。

將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入3D培養(yǎng)的細胞的3D轉(zhuǎn)染試劑盒(BioCellChallenge, SAS)。

多種3D Biotek技術(shù)制造多孔聚合物支架材料填充的3D生物發(fā)生器（3D Bioreactor），即包括可生物降解聚合物(polystyrene, PS)也包括不能生物降解聚合物(polycaprolactone, PCL)類型。

各種預填充了孔狀3D Insert™支架材料的塑料裝置，如3D Insert™ PS (聚苯乙烯)支架，3D Insert™ PCL (聚已內(nèi)酯)支架，3DKUBE™等。

用于骨組織工程中常用的可*吸收的生物陶瓷材料B-TCP盤(Disc)，用于骨質(zhì)疏松癥，骨基質(zhì)礦化，組織鈣化和骨修復等各種骨相關研究的HA盤(Disc)等。

選用3D Biotek產(chǎn)品能獲得高的細胞培養(yǎng)效率；增加細胞因子、抗體和其它生物分子的產(chǎn)出量，且生成的細胞因子、抗體等易于分離；減少動物實驗，體外研究即可獲高預測性資料，在開發(fā)新藥中降低成本和時間，縮短進入市場的時間等優(yōu)點。

更多關于3D Biotek產(chǎn)品的介紹可參考如下鏈接：

http://www.qbiotec.com/qxky001-SonList-1090610/

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370102v7lp.html

三、微流體技術(shù)與3D培養(yǎng)

當前很多研究致力于將微工程學和微流體學與3D培養(yǎng)結(jié)合，開發(fā)灌流3D培養(yǎng)系統(tǒng)（perfused 3D culture systems）。動態(tài)灌流培養(yǎng)比靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)更具優(yōu)勢，細胞能充分接觸到營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。這類產(chǎn)品包括Provitro GmbH的灌流培養(yǎng)體系(Perfusion culture sys. PCS)，3D Biotek公司的3D Perfusion系統(tǒng)，Synthecon公司的旋轉(zhuǎn)3D培養(yǎng)系統(tǒng)RCCS生物反應器，Zellwerk的Z RP (Red Point)培育平臺；Gradientech的CellDirector產(chǎn)品則將細胞趨化與3D環(huán)境相結(jié)合起來。

下面選擇Provitro GmbH灌流培養(yǎng)體系做簡單介紹：

細胞單層培養(yǎng)技術(shù)zui大限度降低了組織復雜性。但其缺點是缺少了細胞與基質(zhì)之間的相互作用，從而導致細胞代謝和細胞表達呈現(xiàn)去分化狀態(tài)。與單層細胞培養(yǎng)技術(shù)比較，3D培養(yǎng)下細胞可通過細胞外基質(zhì)擴展，達到高濃度和營養(yǎng)供應狀態(tài)。Provitro GmbH的3D培養(yǎng)通過自動化的灌流培養(yǎng)體系來滿足3D培養(yǎng)所需要的更嚴格的細胞培養(yǎng)條件，在該體系下培養(yǎng)可保證穩(wěn)定的營養(yǎng)濃度供應，穩(wěn)定的pH值，并降低污染風險。

a)灌流培養(yǎng)體系：Provitro提供的灌流培養(yǎng)體系用顯微鏡可隨時觀察細胞培養(yǎng)狀態(tài)，可保證整個灌流體系內(nèi)細胞營養(yǎng)充足，沒有培養(yǎng)死角；b)管狀細胞灌流培養(yǎng)體系(Tube chamber system TCS)；c)流動灌流培養(yǎng)體系(Flow chamber system FCS)；d)灌流環(huán)路(Perfusion circuit)，包括灌流環(huán)路PCS3c (Perfusion circuit PCS3c)，灌流環(huán)路TCS2c (Perfusion circuit TCS2c)，灌流環(huán)路TCS1c (Perfusion circuit FCS1c)；e)根據(jù)用戶的特殊需求定制的灌流培養(yǎng)體系(Customisation)

Provitro GmbH主要關注組織培養(yǎng)和灌流研究，更多產(chǎn)品信息可參考如下鏈接：

http://blog.sina.com.cn/s/blog_7038ff370101lyxz.html

3D培養(yǎng)的缺點與局限

3D培養(yǎng)對藥物研發(fā)和毒性測試意義重大，但當期也有一些問題尚待解決。包括：當前多數(shù)系統(tǒng)還不能模擬體內(nèi)的生物機械動態(tài)特性；動物源或人源的支撐材料有一定病原風險，且這類材料可能存在批次差別性，在重復性上不及合成的支架材料。Scaffold培養(yǎng)方法在RNA、蛋白提取時需要注意，當然，當前已經(jīng)開發(fā)了酶或是其它試劑在不損傷細胞條件下消化去除這類scaffold，另外，一些生化測定、圖像掃描和熒光檢測方面，scaffold是否存在影響，在選擇產(chǎn)品時需要考慮到。總體上說，材料科學與生物學的結(jié)合使當前3D培養(yǎng)方式越來越多樣化，用戶的選擇空間很大，可在比較中找到自己的方法。眾多的3D培養(yǎng)方法重點關注如何讓3D體系更加接近人體實際環(huán)境，而對藥物研發(fā)企業(yè)，他們除了模擬實際環(huán)境，還要求、自動化和可承受的使用成本。當前3D分析尚須實現(xiàn)飛躍，從而實現(xiàn)3D培養(yǎng)體系工業(yè)化應用便捷和高read-out。