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簡介:世界*品牌TUNEL檢測服務|實驗技術服務原裝,質量保證,*。
TUNEL檢測服務|實驗技術服務——pCzn1質粒+Arctic Express宿主菌低溫表達體系。
我們具備豐富的蛋白表達設計經驗及實驗操作技巧,承諾客戶不成功不收費。在獲得重組蛋白產品的同時,我們也會提供相應的原始數據和原始圖片,不需要再額外花費精力重復實驗。另一方面,我們所有的實驗數據真實可信,我們提供原始的表達菌株和克隆質粒,客戶可以依據我們的實驗報告重復我們的實驗結果。
產品品牌: http://www.。。com/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序實驗流程:
器材與試劑
1、器材:光學顯微鏡及其成像系統、搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的移液器及槍頭等。
2、試劑:試劑盒含TdT 2×、Biotinylated標記的dUTP、標記streptavidin的HRP、SSC 20×、Proteinase k、DAB 20×、DAB底物Buffer 20×、H2O2 20×;
自備試劑:
(1)1×PBS(pH 7.4,2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0.50013075g 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4),115℃×15 min;
(2)0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水,115 ℃×15 min;
(3)4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多,再放入4 ℃保存。
(4)DNase I buffer:40 mM Tris-HCl (pH 7.9)+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2;
(5)Proteinase K buffer:100 mM Tris-HCl (pH 8.0)+50 mM EDTA;
(6)DNase 1(原液1000 U/ml按1:99DNase 1緩沖液稀釋至10 U/ml);
(7)DAB工作液(臨用前配制,5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS)
(8)20 μg/ml Proteinase K工作液(按1:500稀釋貯存液1 mg/ml)。
(9)另外,雙蒸水、無菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇(100、95、85、70、50%)、蘇木素。
實驗步驟
1、脫蠟:用二甲苯浸洗5 min×2次;
2、水化:用梯度乙醇(100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min);
3、浸洗:0.85%NaCl×5 min?PBS洗5 min;
4、固定:浸入4%多聚甲醛15 min;
5、浸洗:PBS 5 min×2次;
6、細胞通透:用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K處理組織15(10~30) min RT;
7、浸洗:PBS洗5 min;
8、固定: 浸入4%多聚甲醛5 min;
9、浸洗:PBS 5 min×2次;
10、平衡:加100 ul平衡液,濕盒平衡10(5~10) min;
11、制備TUNEL反應混合液:處理組用1ul rTdT+1ul 生物素標記的dUTP+98 ul平衡液混勻;而陰性對照組不加rTdT,改為三蒸水;陽性對照組先加入100ul DNase 1 緩沖液孵育5 min,甩掉液體后再加100 ul DNase 1(10 U/ml)酶切10 min,用去離子水沖洗4次,PBS浸洗5 min,后面步驟從第10步開始。
12、標記反應:加100ul TUNEL反應混合液于標本上,加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1 h。
13、終止反應:浸入2×SSC 15 min;
14、浸洗:PBS 5 min×3次;
15、封閉POD:浸入0.3%H2O2 15 min;
16、浸洗:PBS 5 min×3次;
17、酶標反應:加100 ul streptavidin標記HRP(按1:500 PBS稀釋)30 min;
18、浸洗:PBS 5 min×3次;
19、DAB顯色(避光):加100 ulDAB混合液(50 ulDAB+50 ulDAB底物緩沖液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水)10 min左右,鏡下出現淺棕色背景時。
20、用去離子水沖洗幾次;
21、用蘇木素復染,3 s左右后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水(50、70、85、95、100、100%各1 min)、二甲苯透明1 min×2次、中性樹膠封片。
22、加一滴PBS或甘油在視野下,用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共計200~500個細胞)并拍照。可結合凋亡細胞形態特征來綜合判斷(未染色細胞變小,胞膜完整但出現發泡現象,晚期出現凋亡小體,貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落;而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解,染色質分割成塊狀/凋亡小體)。
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