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干細(xì)胞搜網(wǎng)實(shí)驗(yàn)室人員教您如何做好人外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：

在正常情況下，人外周血中是沒(méi)有分裂相的，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。植物血球 凝集素（PHA）是人類(lèi)淋巴細(xì)胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下，原處于Go期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行有絲分裂。利用PHA這一特性，淋 巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)含有HPA培養(yǎng)液培養(yǎng)，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞群體，終止分裂中期的淋巴細(xì)胞，例可得到所需的人體染色體圖形。具有用 血量少、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

　　1、實(shí)驗(yàn)材料
　　2.5%碘酒、75%酒精、無(wú)菌棉簽或棉球、鑷子、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、載玻片等。

　　2、培養(yǎng)液配制
　　無(wú)菌條件下配制培養(yǎng)液，每瓶所含下列試劑：
　　RPMI 1640或199 90%
　　小牛血清 10%
　　PHA（自制） 0.1ml 3%
　　肝素 10u/ml 2%
　　雙抗 100u/ml（選擇）
　　分裝于10ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶5ml培養(yǎng)液，封口置冷藏柜備用。

　　3、操作過(guò)程
（1）采樣接種：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶蓋，用酒精燈火焰過(guò)烤，無(wú)菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，輕搖均勻，盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸；
（2）培養(yǎng)：置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，每隔12小時(shí)左右輕遙1次，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖；
（3）抑止分裂：收獲前2小時(shí)左右加秋水仙素，zui終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以抑止細(xì)胞在分裂中期。
（4）終止培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，搖勻后移至10ml尖底離心管中，盡量收集培養(yǎng)細(xì)胞。2000rpm8分鐘。
（5）低滲處理：棄上清液，加入預(yù)溫37℃的0.075MKCL8ml，迅速打勻，置37℃培養(yǎng)箱或水浴鍋中10-20分鐘；
（6）預(yù)固定：取出低滲中尖底離心管，輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相應(yīng)編號(hào)滴管用汽泡輕輕軟打2-3下。800-1000rpm8-10分鐘；（7）固定：棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲 醇冰乙酸混合液10ml，輕打混勻，封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘，反復(fù)2-3次；
（8）制片：使用蒸餾水制備冰水片進(jìn)行滴片。留離心后沉淀細(xì)胞，加新鮮配制的固定液，制成細(xì)胞懸液，取1-2滴滴片，用于輕輕吹開(kāi)。刻號(hào)后清理刻號(hào)污物，置80℃烤片2小時(shí)；
（9）收片：待烤箱自然冷卻后，取出烤片，置干凈環(huán)境中或培養(yǎng)箱中以備進(jìn)行顯帶處理。