產品簡介

經親和純化的 mouse anti-rabbit IgG (Conformation Specific) HRP Conjugate antibody。

產品使用信息

推薦的抗體稀釋度:1:2000

特異性/靈敏度

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) 可識別天然兔 IgG。該抗體可能與高濃度的變性[輕鏈] IgG 發生交叉反應。

來源/純化

使用總天然兔 IgG 對動物進行免疫接種來產生單克隆抗體。

使用流程

蛋白質印跡法實驗步驟

為了進行蛋白質印跡,在 4°C 將膜與 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^® 20 中稀釋的一抗孵育過夜,同時柔和振搖。

注意:請參閱一抗產品網頁了解推薦的抗體稀釋度。

A. 溶液與試劑

從樣品制備至檢測,進行蛋白質印跡所需要的試劑現歸于一個便利的試劑盒

注:使用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水配制溶液。

1. 20X 磷酸鹽 (PBS):若要制備 1 L 1X PBS:將 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH₂O,混合。

2. 10 X Tris 緩沖鹽水 (TBS):若要配制 1 L 1X TBS:將 100 ml 10X 添加至 900 ml dH₂O ,混合。

3. 1X SDS 樣品緩沖液:Blue Loading Pack或 Red Loading Pack通過將 1/10 體積的 30X DTT 添加至 1 體積的 3X SDS 樣品緩沖液,配制新鮮的 3X 還原性上樣緩沖液。用 dH₂O 稀釋至 1X。

4. 10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液:若要配制 1 L 1X 電泳緩沖液: 將100 ml 10X 電泳緩沖液添加至 900 ml dH₂O ,混合。

5. 10X Tris-Glycine 轉移緩沖液:要制備 1 L 1X 轉移緩沖液:將 100 ml 10X 轉移緩沖液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中,并混合。

6. 含有 Tween^® 20 (TBST) 的 10 X Tris 鹽緩沖液:要制備 1 L 1X TBST: 將 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。

7. 脫脂奶粉

8. 封閉緩沖液:含 5% w/v 脫脂奶粉的 1X TBST;要制備 150 ml,將 7.5 g 脫脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混勻。

9. 洗滌緩沖液: 1X TBST。

10. 牛血清白蛋白 (BSA) 

11. 一抗稀釋緩沖液:含 5% BSA 的 1X TBST;要制備 20 ml,添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST,然后充分混勻。

12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack

13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)

14. 印跡膜:本實驗步驟針對硝酸纖維素膜進行了優化。通常推薦 0.2 μm 孔徑。

15. HRP 偶聯二抗:Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody。

16. 檢測試劑:SignalFire™ ECL Reagent。

B. 蛋白質印跡

制備樣品的常規流程。

1. 添加含有調節因子的新鮮培養基,使其對細胞進行處理一段時間。

2. 從培養物中吸出培養基;用 1X PBS 洗滌細胞;吸出。

3. 加入 1X SDS 樣品緩沖液(6 孔板每孔 100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl)來裂解細胞。立即從板上刮下細胞并將提取物轉移至微量離心管。置于冰上。

4. 超聲處理 10–15 秒以完成細胞裂解并剪切 DNA(以降低樣品粘度)。

5. 取 20 μl 樣品,在 95–100°C 下加熱 5 分鐘;放在冰上冷卻。

6. 微量離心機內離心 5 分鐘。

7. 上樣 20 μl 到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。

注意:建議將預染蛋白分子量標準品(10 μl/泳道)上樣,以驗證轉膜的效率,化蛋白質標準品(10 μl/泳道)可以直接在膜上顯出條帶以確定分子量。

8. 電轉至硝酸纖維素膜。

C. 膜封閉和抗體孵育

注意:體積適用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜;對于不同尺寸的膜,可相應調整體積。

I. 膜封閉

1. (可選)轉移之后,在室溫下用 25 ml TBS 將硝酸纖維素膜洗滌 5 分鐘。

2. 將膜置于 25 ml 封閉緩沖液中,在室溫下孵育 1 小時。

3. 用 15ml TBST 洗滌三次,每次 5 分鐘。

II. 一抗孵育

1. 將膜和一抗(按照產品網頁中建議的適當稀釋度和稀釋液)置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2. 用 15ml TBST 洗滌三次,每次 5 分鐘。

3. 使用 10 ml 封閉緩沖液稀釋 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (按 1:2000 的比例)和 anti-biotin, HRP-linked Antibody (按 1:1000–1:3000 的比例)用以檢測化蛋白標準品。將膜與稀釋液一起孵育,在室溫下輕輕搖晃孵育 1 小時。

4. 用 15ml TBST 洗滌三次,每次 5 分鐘。

5. 繼續進行檢測(D 部分)。

D. 蛋白質檢測

使用說明:

1. 在 TBST 中清洗與膜結合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次,持續 5 分鐘。

2. 通過稀釋一部分 2X 試劑 A 和一部分 2X 試劑 B(例如:要制備 10 ml,則添加 5 ml 試劑 A 和 5 ml 試劑 B),來制備 1X SignalFire™ ECL Reagent。混勻。

3. 將底物與膜一起孵育 1 分鐘,倒掉多余溶液(膜將保持濕潤),然后包裹在塑料中并在 X 線膠片下曝光。

* 避免反復接觸皮膚。

溶液和試劑

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1% Triton、2.5 mM 焦磷酸鈉、1 mM β-甘油磷酸、1 mM Na3VO4、1 μg/ml 亮抑酶肽:CST 建議在使用前立即添加 1 mM PMSF。

保存/存儲方法

保存在 136 mM NaCl、2.6 mM KCI、12 mM (pH 為 7.4) 、2 mg/ml BSA 和 50 % 甘油中。-20℃ 保存。切勿分裝抗體。

支持性數據

來源/同種型:小鼠

應用關鍵詞:

WB- 蛋白質印跡法 IP-免疫沉淀法 IHC-免疫組織化學法 ChIP-染色質免疫沉淀法 IF-免疫熒光法 F-流式細胞術 E-P-ELISA 肽

物種交叉反應性關鍵詞:

H-人 M-小鼠 R-大鼠 Hm- 倉鼠 Mk-猴 Vir- 病毒 Mi-水貂 C-雞 Dm-黑腹果蠅 X-爪蟾 Z-斑馬魚 B-牛 DG-犬 PG-豬 Sc-釀酒酵母 Ce-秀麗隱桿線蟲 Hr-馬 All-預期所有物種

背景

Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 僅會與天然 IgG 發生反應,并且不會結合變性和還原的兔 IgG 重鏈或輕鏈。進行免疫沉淀 (IP) 后再進行蛋白質印跡實驗時,用于進行免疫沉淀的一抗的變性兔 IgG 輕鏈和重鏈在隨后的蛋白質印跡實驗中分別約為 25 和 50 kDa,并且通常會掩蓋分子量相似的蛋白條帶。Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb 用作二抗可避免這個問題。