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使用NINJ1抗體抑制膜撕裂限制組織損傷

背景部分介紹：

NINJ1是一種16 kDa的細胞表面蛋白，預計具有兩個跨膜區域，并且在細胞外部具有N和C端。雖然對細胞死亡的誘導是非必要的，但NINJ1控制著細胞凋亡或焦亡的一個重要后果，介導PMR （plasma membrane rupture），非選擇性地從死亡細胞中釋放促炎細胞質內容物。NINJ1依賴性PMR是否會加重疾病中的組織損傷尚不清楚，但據報道，在小鼠模型中，Ninj1缺乏可減輕肺纖維化和多發性硬化癥。鑒于NINJ1的一個保守的細胞外區域對其寡聚化和PMR至關重要，作者假設細胞外抗NINJ1抗體可以用來抑制體內依賴NINJ的PMR。

在介紹本文內容前，推薦兩篇相關的文獻，希望為大家提供更好的背景方面的了解。

第一篇如下，NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death, 是由同一作者于2021年發表于nature的文章，初步描述了NINJ1在細胞焦亡過程中對質膜撕裂的作用。

第二篇，structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death, 巧合的是這篇文章與我們要解析的文章同一天發表在nature上，但作者不同。這篇文章詳細解析了NINJ1的空間構象。

在NINJ1出現之前，大家普遍認為細胞焦亡過程中，細胞腫脹后引起的質膜撕裂是被動的，隨著關于NINJ1在nature的三篇文章出現，相信大家對該基因的重要性有了共同認識，那么接下來NINJ1是否會成為細胞死亡領域里的研究新寵呢？

主要結果部分：

1.NINJ1阻斷抗體克隆D1的鑒定

為了產生Ninj1阻斷抗體，作者用表達全長小鼠NINJ1的細胞外囊泡免疫Ninj1?/?小鼠a。通過流式細胞術分析分離了大約15000個結合NINJ1的IgM?B細胞，并鑒定了單細胞上清與表達NINJ1的細胞的結合。217個重組抗小鼠NINJ1 IgG2a單克隆抗體的功能篩選鑒定克隆D1 (NINJ1- 575)為NINJ1依賴性PMR抑制劑b。另外驗證了D1只結合鼠NINJ1 C。克隆D1識別NINJ1的C端表位，而對照克隆25識別N端表位d。

2. D1可有效抑制NINJ1依賴性PMR

為了擴展對BMDMs的分析，我們通過延時活細胞成像來監測NINJ1依賴性PMR。用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯的150 kDa葡聚糖(DD-150)裝載Pam3CSK4-primed BMDMs，并使用尼日利亞菌素刺激后的染料釋放量作為PMR的指標，發現克隆25和D1均表現出PMR阻斷活性，但后者更有效a。雖然二者都能阻斷PMR，但不能抑制膨脹泡的形成c。

3. 克隆D1減弱了NINJ1的寡聚化

假設克隆D1通過阻止NINJ1的寡聚化來阻斷BMDMs中的PMR。為了與這種機制保持一致，尼日利亞菌素在野生型bmdm中誘導了NINJ1的斑點狀組裝，但這些在D1 Fab克隆存在時不那么普遍a, b。還檢測了克隆D1對瞬時轉染人Expi293F細胞純化的n端flag標記小鼠NINJ1的影響。通過隔離層析(SEC)，純化后的Flag-NINJ1作為高分子量的物種遷移(在8.5 ml保留體積時達到峰值)，相比之下，當Flag-NINJ1與克隆D1 Fab共表達時，純化的NINJ1-Fab復合物以低分子量的物種遷移(在15ml保留體積時達到峰值)。c。另陰性染色電鏡顯示，Flag-NINJ1形成了形狀各異的低聚結構，包括環狀、長絲、團簇和圓弧，其尺寸可達200 nm，與D1 Fab共存在時無高階低聚物結構形成d。

4. 克隆D1限制了NINJ1依賴性PMR和DAMP的釋放

該實驗采用了小鼠模型NINJ1fl/flRosa26-creERT2 mice: 該小鼠品系能夠在成年鼠中引起他莫昔芬誘導的系統性NINJ1缺失。

a-d探討了NINJ1在細胞凋亡相關PMR中的作用：

在他莫昔芬治療后，NINJ1fl /flRosa26-creERT2小鼠和Rosa26-creERT2對照小鼠給予TNF和轉錄抑制劑D-半乳糖胺(D-Gal)誘導肝細胞凋亡，TNF +D-Gal引起Rosa26-creERT2小鼠的暴發性肝細胞PMR，血清中ALT、AST和LDH升高，而TNF + D-Gal處理的NINJ1缺陷小鼠血清中ALT、AST和LDH含量顯著較低a。對照肝臟的組織學分析顯示，TNF + d-Gal引起以收縮性肝細胞死亡伴出血為特征的大面積病變，NINJ1缺陷肝細胞表現出與PMR功能障礙相關的腫脹形態b, c。免疫標記顯示，這些病變中裂解的caspase-3（細胞凋亡的標志）呈陽性d。這些數據表明NINJ1在體內介導凋亡相關的PMR。

接下來，檢測克隆D1是否可以限制TNF + d-Gal誘導的肝損傷e-g：

野生型小鼠在注射TNF + D-Gal前2小時給予同型對照抗體，血清ALT、AST和LDH水平顯著升高，表明肝細胞PMR增強，與NINJ1缺乏癥類似，D1克隆預處理顯著減弱誘導的血清LDH、ALT和AST升高e。隨后發現TNF + D-Gal以NINJ1依賴的方式增加了血清中DAMPs IL-18和HMGB127的水平f, g。

模式圖推測：

最后，針對文章的研究，小優博士在這里制作了一張推測的模式圖，供大家參考。

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