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哈嘍，最近發(fā)現(xiàn)很多小伙伴詢問活體轉(zhuǎn)染關(guān)于玻璃體注射的應(yīng)用，今天小編就帶著幾篇相關(guān)應(yīng)用文獻來給大家簡單介紹一下。

第一篇是來自中山大學(xué)中山眼科中心余克明教授與莊菁研究員團隊發(fā)表在Cell Death and Disease雜志上，題為"Lithium promotes DNA stability and survival of ischemic retinal neurocytes by upregulating DNA ligase IV"。

本文中，作者直接在缺血性大鼠視網(wǎng)膜中直接測試了鋰對DNA NHEJ（非同源末端連接）活性的影響。I/R（缺血再灌注） 手術(shù)后，如材料和方法中所述遞送NEHJ底物即線性化 pEGFP-N1。轉(zhuǎn)染后48 h，固定眼球，切片并檢查GFP表達。正如預(yù)期，RGC層顯示出最大的活性（圖1c），并且在I / R手術(shù)中，鋰顯著促進了DNA NHEJ活性（*P<0.05;圖1d）。有趣的是，即使沒有 I/R 手術(shù)，鋰也促進了 NHEJ，效率提高了 1.83 倍 （*P<0.05）。作者推測，觀察到這種效應(yīng)是因為轉(zhuǎn)染對RGC層中的細(xì)胞造成輕度損傷。此外，在I/R手術(shù)組中，鋰促進了DNA NHEJ活性的2.4倍（**P<0.001）。即使沒有鋰預(yù)處理，I/R 手術(shù)也顯著增強了 NHEJ 事件 （**P<0.001）。 這些結(jié)果與先前的報道部分一致，即缺血刺激自發(fā)激活DNA修復(fù)，并且鋰在病理性缺血狀態(tài)下促進DNA修復(fù)

圖 1. (C).體內(nèi)DNA NHEJ測定。（NHEJ修復(fù)測定的策略如圖3d所示。）I/R手術(shù)后24小時，按照制造商的說明，在轉(zhuǎn)染試劑（in-vivo jetPEI）后，用線性化質(zhì)粒pEGFP-N1進行玻璃體內(nèi)注射。在轉(zhuǎn)染后48小時，將視網(wǎng)膜固定并切片。在RGC層中可檢測到GFP。比例尺：100μmm (D).大鼠視網(wǎng)膜中GFP陽性細(xì)胞的比較。鋰預(yù)處理促進DNA NHEJ活性（假，0.67±0.62;假+鋰， 1.25±0.72; I/R 手術(shù)，5.5±1.19;I/R 手術(shù)+鋰，13.25±1.83）。n=8，每組，*P<0.05。**P<0.001。所有誤差線均代表 SEM

方法

配置質(zhì)粒/in vivo jetPEI 復(fù)合物：EcoR1切割質(zhì)粒pEGFP-N1后通過添加超純水調(diào)整濃度至4 μg/μl。根據(jù)生產(chǎn)商操作方法配置轉(zhuǎn)染復(fù)合物：將所需量的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別用10 μl 10%葡萄糖稀釋。每 μg線性化質(zhì)粒pEGFP-N1添加0.05 μl in -vivo jetPEI。將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合并在室溫下孵育15min后形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物即可注射。pcDNA3.1作為陰性對照。

玻璃體內(nèi)注射：共32只重250-300g成年 Sprague–Dawley 大鼠用于玻璃體內(nèi)注射。實驗分為2組（每組16只大鼠）：實驗組和對照組。實驗組每天皮下注射氯化鋰一次，從缺血前1周開始，到組織取樣當(dāng)天結(jié)束，而對照組僅接受相同量的PBS。每日氯化鋰劑量1.0mEq/kg。每組分為兩個亞組（每個亞組8只大鼠）：取一個亞組進行I/R實驗，另個亞組不進行I/R作為對照。I/R手術(shù)后24小時，對所有大鼠的右眼進行玻璃體內(nèi)注射。每次注射2.5 μl 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使用Hamilton注射器在無菌條件下進行玻璃體內(nèi)注射。

第二篇是最近發(fā)表在Communications Biology上題為“Vascular cell-adhesion molecule 1 (VCAM-1) regulates JunB-mediated IL-8/CXCL1 expression and pathological neovascularization"血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）調(diào)節(jié) JunB 介導(dǎo)的 IL-8/CXCL1 表達和病理性新生血管形成

VCAM-1敲除小鼠由于胎盤發(fā)育缺陷導(dǎo)致胚胎致死，所以這里作者使用玻璃體內(nèi)注射 VCAM-1 siRNA 來評估 VCAM-1 缺失對 OIR（氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變）誘導(dǎo)的小鼠病理性視網(wǎng)膜血管生成的重要性。我們在 P12 和 P14 時進行玻璃體內(nèi)注射 0.5 μl 含有in- vivo jetPEI® 轉(zhuǎn)染試劑和 1 μg 對照或 VCAM-1 siRNA 的 5% 葡萄糖溶液。在P15時，對眼睛進行眼球摘除，分離視網(wǎng)膜，并制備視網(wǎng)膜提取物，并分析常氧和缺氧視網(wǎng)膜中的CXCL1、JunB和VCAM-1水平。與對照 siRNA 組相比，注射 VCAM-1 siRNA 的小鼠缺氧誘導(dǎo)的 CXCL1、JunB 和 VCAM-1 表達減弱（圖 2a）。在 P17 時，視網(wǎng)膜也用異凝集素 B4 染色，平放，并量化新生血管形成或缺血面積的百分比。VCAM-1水平減弱的缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成（圖2b和c）和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（EC）尖duan細(xì)胞形成（圖2e）的下調(diào)。在對照組或VCAM-1 siRNA組的缺血面積方面未觀察到顯著差異（圖2d）。這些觀察結(jié)果表明，VCAM-1 在 OIR 小鼠模型中調(diào)節(jié) JunB-CXCL1 信號傳導(dǎo)和病理性視網(wǎng)膜新生血管形成。

圖2. 將 C57BL/6 小鼠幼崽暴露于 75% 氧氣 （P7-P12） 中，返回室內(nèi)空氣中，并在玻璃體內(nèi)注射 0.5 μl 的5% 葡萄糖溶液 包含in vivo jetPEI®的 和 1 μg 對照或 在P12 和 P14 的 VCAM-1 siRNA。在 P15 時，眼球摘除，分離視網(wǎng)膜，制備組織提取物并分析 ，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測 CXCL1 和JunB水平，并在印跡中重新檢測 VCAM-1 和 β-tubulin，用來顯示 siRNA 對其靶標(biāo)和脫靶分子的影響。b、d、e 一切都與圖 （a） 相同，除了在 P17 時，眼睛被摘除，視網(wǎng)膜分離，用異凝集素 B4 染色，準(zhǔn)備平坦支架并檢查視網(wǎng)膜新生血管形成 （b）、缺血區(qū) （d） 和內(nèi)皮jian端細(xì)胞形成 （e）。面板 b 中的中間列顯示所選區(qū)域的較高放大倍率。新生血管在圖（b）的第三列中以紅色突出顯示。c、d 條形圖表示新生血管形成 （c） 和缺血面積 （d） 的定量分析。n = 每組 8 只 （c， d） 每組為生物學(xué)獨立的眼睛，用平均值表示± SD。 *P < 0.05 與 siControl。在面板 （b） 左列和右列中 比例尺代表500 μm，面板 （b） 中列代表20 μm，面板 （d）中代表 500 μm，面板 （e） 上行代表 20 μm，面板 （e） 下行代表 50 μm。

方法：

小鼠在12小時光照/12小時黑暗循環(huán)環(huán)境中飼養(yǎng)和繁殖，并隨意喂食水和食物。在出生后第7天（P7），在BioSpherix室中將有母鼠的小鼠幼崽暴露于75%的氧氣（高氧）5天（P7-P12），在P12時，幼鼠和母鼠一起返回室內(nèi)空氣。對于對照組，將同齡小鼠幼崽保持在21%氧氣（即室內(nèi)空氣）下。在 P12 和 P14 時，in- vivo jetPEI和1ug siRNA混合在終濃度為5%葡萄糖溶液中形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使用35?G針對小鼠幼崽玻璃體注射劑量為0.5uL轉(zhuǎn)染復(fù)合物。

相關(guān)文獻

[1] Yang, Ying , et al. "Lithium promotes DNA stability and survival of ischemic retinal neurocytes by upregulating DNA ligase IV." Cell Death & Disease 7.11(2016):e2473.

[2] Kaur, Geetika , et al. "Vascular cell-adhesion molecule 1 (VCAM-1) regulates JunB-mediated IL-8/CXCL1 expression and pathological neovascularization." Communications Biology 6(2023).

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