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                                   第八章 抗體孵育

一抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一抗的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋一抗。吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的一抗，室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動孵育 1～2 小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在 4℃緩慢搖動孵育一夜。（注意：抗體濃度過高會導致背景較深，過低會導致和抗原結合不充分，出現假陰性 ）。回收一抗。然后加入 Western 洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫或 4℃在搖床上緩慢搖動孵育 1～2 小時。回收二抗。然后加入 Western 洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌 5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。前 2 步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結合，減少背景。同時短時間多次的洗膜（如 5-6 次，每次 3 分鐘）比長時間少次數的洗膜更有效。第 3 步 TBS 洗滌是為了洗去膜上的 Tween-20，因為它可以阻礙底物的沉積。

  注意事項

1. 抗體保存注意事項：

收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝和保存！

對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃ 。

分裝的量以一次實驗用完為好，zui少不能少于 10 ul 每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在 40℃，避免再凍起來！

避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

大部分抗體收到后 40℃短暫保存 1-2 周對抗體活性是沒有影響的。長期保存，加入疊氮納，防止細菌污染。

2. 一抗/二抗使用問題：

   一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇zui適當的比例，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。

3. 天然和非還原樣品問題：

   有些抗體只能識別的表位是非連續氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質一級結構中彼此不連續，但是在空間結構中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結構狀態（抗體說明書中會有特殊說明）。對于這些樣品，緩沖液和凝膠中就不能含有 SDS，并且不能夠對蛋白進行加熱變性。有些抗體只能識別蛋白的非還原狀態如氧化狀態，對此類樣品，就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑 DTT和 beta-巰基乙醇去除。