陳老師，空的傳感器怎么和分析物有非特異性吸附了？
有多少信號呢？
和有固化物的信號差不多呢
很多科研人員在分子互作實驗中，常常會遇到非特異性結合的問題，今天陳老師就跟大家聊一聊固液反應中普遍存在的非特異性結合。基于固液反應的檢測方法有很多：如親和層析、免疫標記技術（ELISA）、微陣列芯片技術、SPR、BLI等。本文所使用的數據均來自基于Octet®非標記分子互作分析系統的生物層干涉技術（BLI）固液反應技術。
Q1
什么是非特異性結合？
提到非特異性結合，有兩個含義：一是固化物與分析物之間的結合，但是這種結合并不是我們期望的。另外一個是指不發生在分析物與固化物質之間的反應。今天我們討論的是如何消除后者意義上的非特異性結合。而這種非特異性其中又包含了兩層意思：
分析物直接與去除固化物的固相介質結合
分析物緩沖液中其他物質（雜質）與有固化物的固相結合
圖1. a)分析物結合到空白傳感器；b)分析物緩沖液的組分結合固化物
Q2
非特異性作用使如何產生的？
1 分析物與介質之間的靜電作用：常用的介質（如海藻酸和葡聚糖）在特定的pH下會帶有大量電荷。如果分析物帶有相反電荷，就容易形成基于庫侖力的靜電作用。
2 分析物與介質之間的疏水作用：如果雜質或分析物是蛋白質或帶有疏水基團的化合物，而基質也是蛋白質（比如鏈霉親和素傳感器），就可能形成基于疏水作用的非特異性吸附。
3 分析物與固化物之間的生物相似性：在基于捕獲的固化反應中，分析物帶有與固化蛋白相同的標簽。比如，用帶有His抗體的基質固化His標簽的蛋白，但如果分析物中有相同的標簽，就很難避免His標簽的分析物直接與固相反應。
4 雜質的作用：在諸如血液、細胞裂解液等粗樣品中，雜質產生的非特異性作用很普遍。一個典型的案例就是牛血清白蛋白（BSA）。作為一種常用的封閉試劑，由于來源和純化工藝的不同，一些廠商提供的BSA可能會帶有一定量的牛免疫球蛋白。
圖2. 用proA傳感器檢測IgG，因為緩沖液中的BSA中含有牛免疫球蛋白，從而造成了很高的背景
Q3
如何減輕或者消除非特異性吸附？
solution 1
降低分析物濃度
這種情況適合于有固化ligand的傳感器與分析物信號大大高于無ligand傳感器，但是非特異性信號依舊明顯。比如，1000nM和500nM的分析物濃度下有非特異性信號，而250nM沒有，則把最高濃度改成250nM即可。
圖3. 左圖為高濃度結合曲線，右圖為降低濃度后結合曲線。綠色為有固化傳感器與分析物，黑色為同樣分析物濃度下非特異性信號。
優點：不需要太多優化實驗，操作簡單。
缺點：使用條件有限。而且分析物濃度降低后，可能導致結合信號降低，可能需要延長結合時間或者提高固化ligand的信號。
solution 2
增加封閉步驟或優化分析緩沖液
這是去除非特異的主要方法。為什么將看似兩種方法放在一起呢？因為通常在確認了最佳封閉試劑后，會將其添加到分析緩沖液中。例如，如果1%的酪蛋白封閉效果最好，一般分析緩沖液中也會含有1%的酪蛋白。
然而，優化緩沖液還包括增加鹽離子濃度、加入去污劑、調節pH等，具體見下表。
分析物緩沖液中一般加入tween20，濃度在0.02%—0.05%。
優點：成本低，可以通過實驗設計一次性完成優化。
缺點：可能會影響特異性結合，比如特異性結合主要依賴靜電作用，而非特異性也是靜電作用。如果提高鹽濃度，在降低非特異性的同時，特異性信號也降低了。因此，必須要用特異性信號與非特異性信號的比值來判斷優化的效果。
下表顯示了在不同封閉緩沖液中，特異性信號（有固化物傳感器）與非特異性信號（無固化物傳感器）比值。使用Ni-NTA固相，可以看到在非特異性低的情況下，0.2%酪蛋白的封閉效果最好。
圖4展示了使用高濃度的鹽離子去除非特異性吸附。作者檢測CHO表達上清（粗樣品）中的EPO，發現固相與空載表達上清有很強的非特異性。然而，加入500mM的NaCl后，非特異性顯著降低。
圖4. 數據來自于Development of a VHH-Based Erythropoietin Quantification Assay.Mol Biotechnol，DOI 10.1007/s12033-015-9860-7
solution 3
更換固相的基質或材料
首先需要明確在檢測步驟前固相上的基質有幾層。例如，在雙抗夾心ELISA中，涉及到96孔板的材質和第一個抗體等膜層。如果第二個抗體如果直接和這些膜層結合，就會發生非特異性吸附。此時，可以更換第一個抗體或者第二個抗體，甚至更換96孔板的材質，以減輕非特異性吸附。
一些固相材料也可能由多層基質組成，例如某些固相基質主要是玻璃和氨基硅烷構成，這些材質上又鍍有鏈霉親和素或者海藻酸。如果與玻璃或者氨基硅烷有非特異性吸附，那么就只能用方法1、3、4去除非特異性吸附。如果與鏈霉親和素結合，可以更換基于海藻酸基質的氨基偶聯的芯片。
優點：可能從根本上去除非特異性吸附，并且保證特異性結合不受影響。
缺點：成本較大（比如SPR技術的金膜芯片），需要重新研發新介質或者購買新傳感器，并且很多傳感器介質是個固定的，很難改變。
solution 4
固化物和分析物對換
（如果固化物非特異性吸附）
即固化之前的分析物，檢測固化物。
優點：不需要準備新的試劑或者耗材。
缺點：有些技術實現起來非常困難，比如基于微陣列的方法以及基于雙抗夾心的方法。
solution 5
盡可能去除分析物中的雜質
比如，提高分析物的純度、提高緩沖試劑的質量，或對粗樣品進行離心等簡單處理。
優點：可以順便提高純化和提取工藝。
缺點：耗時長、成本高，并且某些檢測的初衷就是檢測粗樣品。
solution 6
計算扣除法
即設置非特異性對照，并從所有數據均扣減非特異性信號。雖然這種方法有點“取巧”，但以下三種情況下可以使用計算扣除法：
A
在特異性信號遠大于非特異性信號的時，可以采用這個方法。
B
分析物濃度很高（比如μM蛋白濃度以上），且難以通過優化緩沖液和封閉方法去除非特異性信號的時候，可以嘗試使用計算扣除法。
C
在實時檢測反應中（比如SPR、BLI技術），如果特異性反應的結合解離特點與非特異性反應完全不一樣的時候可以計算扣除，比如前者是快解離快結合，后者是慢結合慢解離的時候。
優點：不需進行實驗優化。
缺點：比較主觀，一般來說非特異性信號會影響特異性信號。因為生物樣品的多樣性，非特異性是不可避免的。然而，只要按照上面的方法，先弄清非特異性的種類，再進行針對性的合理優化，還是可以有效地消除非特異性結合。
Octet®非標記分子互作分析系統的優勢
非標記Direct Binding是趨勢，結果更準確
快速測定親和力，更加定量化地表征分子互作
無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
寫入了美國藥典，文章多，認可度廣
萬金油技術，可以用與檢測DNA，小分子，蛋白質等各種生物分子
多種實驗方案，除了直接測試，還有競爭法，垂釣等
操作簡便，耗材及維護成本低
《生物層干涉技術小分子應用文集》
《生物層干涉技術小分子應用文集》詳細介紹了生物層干涉（BLI）技術的原理，及其在小分子領域的多個應用場景，并對BLI技術應用于小分子研究的20余篇代表性文獻進行了整理匯總：內容涵蓋從防御機制到垂釣驗證，再到小分子篩選、表征、優化等多個方面，全展示了BLI技術在小分子研究中的強大潛力和實踐成果。
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