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T細胞有兩種CAR，針對兩種腫瘤特異性抗原（TAA），兩種CAR帶有不同的傳導信號激發因子。只有兩種CAR同時結合兩種TAA，才能共激發對腫瘤殺傷效應的信號轉導稱為AND；一旦結合一種正常細胞表達的抗原就不激發稱為NOT；結合一種TAA就激發稱為OR。

最近的一篇來自于斯坦福大學的NATURE文章中[2]，作者使用ZAP-70（一種細胞內近端T細胞信號分子）取代傳統的CD3ζ 結構域分子，可以激活T細胞并在體內根除腫瘤，同時可以繞過上游信號傳導。ZAP-70的主要作用是磷酸化LAT和SLP-76，于是將LAT和SLP-76設計成基于AND的邏輯門控細胞內網絡（LINK CAR）。但是從這篇文章來看，這種AND設計并不是一帆風順的。

這篇文章評估CAR-T細胞殺傷作用的主要方法用到了大家耳熟能詳的Incucyte® 實時活細胞分析系統，Incucyte® 也成為這篇NATURE的核心技術。

在設計AND邏輯門的CAR時，一個關鍵問題是如何避免出現自發二聚體，降低腫瘤殺傷的特異性作用。

首先，是對不同跨膜域的選擇，考慮到如果用同樣的跨膜結構域可能會產生二聚體，所以應盡量使用不同的跨膜結構域。基于此，作者首先研究了AA，BB，AB，BA四種跨膜域組合（A為CD28TM，B為CD8TM）。

圖3：Incucyte® 實驗顯示,只有CD19-28TM-LAT+HER2-8TM-SLP-76（AB組合）顯示出了一定的AND作用，但是仍然殺傷了CD19單陽。

為了進一步降低同源二聚或者異源二聚的可能性，突變了CD28TM上的一個半胱氨酸位點（2CA），但是仍然無法提高特異性。

LAT和SLP-76不會結合，為什么還是不行呢？作者進一步研究了這個信號通路發現，下游的一個適配分子 GADS，可能會同時和兩個CAR結合，所以依然會形成二聚體。所以將兩個CAR上的GADS結合位點的敲除后，特異性就提高了，真正獲得了AND效果！

當然作者也嘗試了其他抗原組合，比如CD19和ROR1，這種LINK CAR依然有效！

當然這種AND效果方法不只一個，比如SynNotch，但是相對于SynNotch，這篇文章的LINK顯示出更佳的特異性。

這種CAR可以擴大CAR-T細胞靶向的分子范圍，并將使CAR-T能夠用于實體瘤和自身免疫等疾病和纖維化。此外，這項工作表明，細胞的內部信號機制可以重新利用為表面受體，其可能為細胞工程開辟新的途徑。

為什么越來越多的高分文章都使用了Incucyte® ？