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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,制藥 |
|---|
產品介紹
產品簡介
Hifair® Advanced One Step RT-qPCR SYBR Green Kit是一款基于SYBR Green I染料進行熒光定量的試劑盒。使用基因特異性引物，反轉錄和qPCR反應在一管內完成，無需反復的開蓋和移液操作，大大提高了檢測效率，并降低了污染的風險。對于RNA樣本，試劑盒采用耐熱Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成cDNA，同時采用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase進行定量擴增。在優化的緩沖體系下，該試劑盒的檢測靈敏度針對高表達的靶標, 可以檢至0.1 pg，中等表達的靶標，可以檢至1 pg。該試劑盒同時也適用于DNA樣本的擴增定量。該試劑盒可實現不同動植物樣本、細胞、微生物核酸的高靈敏檢測和定量。
產品信息
貨號 | 11175ES20 / 11175ES70 |
規格 | 20 T / 200 T |
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 11175ES20 | 11175ES70 |
11175-A | 2× Hifair® Advanced SG Buffer | 250 μL | 2×1.25 mL |
11175-B | Hifair® Advanced UH Enzyme Mix | 20 μL | 200 μL |
11175-C | RNase free H2O | 250 μL | 2×1.25 mL |
儲存條件
-25~-15℃避光儲存，有效期1年。
使用說明
推薦反應體系
組分 | 體積（μL）**** | 體積（μL） | 終濃度 |
12.5 | 25 | 1× | |
Hifair® Advanced UH Enzyme Mix | 1 | 2 | - |
Forward Primer (10 μM)** | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)** | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
模板 RNA*** | X | X | |
RNase-free ddH2O | to 25 | to 50 |
表1反應體系*****
** 通常引物終濃度為0.2 μM，也可根據情況在0.1-1 μM之間進行調整。
*** 該試劑靈敏度，Total RNA在1 pg – 1 μg，人源樣本測試顯示最佳投入量為1 pg – 100 ng，控制Ct值整體在15-30之間為宜。
**** 推薦使用20 μL或 50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
***** 請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
反應程序
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
反轉錄 | 50℃* | 6 min | 1 |
預變性 | 95℃ | 5 min | 1 |
擴增反應 | 95℃ | 15 sec | 40 |
60℃** | 30 sec | ||
熔解曲線 | 儀器默認設置 | 1 | |
表2 標準擴增程序
* 反轉錄溫度可根據實驗需求在50-55℃之間進行選擇。對于DNA樣本，反轉錄過程可省去。
** 特殊情況下退火/延伸溫度可根據引物Tm值進行調整，建議使用60℃。
3. 適用機型
不需要Rox校正的儀器型號：
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler2.0, Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR;
Low Rox適用機型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6, 7, 12k Flex;
Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;
High Rox適用機型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus.
4. 引物設計技巧
1）引物最好應設計成跨越一個外顯子-外顯子連接，其中一條擴增引物可以潛在地跨越實際外顯子-內含子邊界。這種設計可以減少從污染的基因組DNA中擴增到假陽性的風險。
2）引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。
3）引物長度一般在18~27 bp，不應過長否則導致其延伸溫度過高，不適于Taq DNA 聚合酶反應。
4）引物GC含量在40%~60%，GC含量過高或過低都不利于反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。可按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估算引物的Tm值，也可以通過軟件計算引物Tm值。
5）PCR產物的長度通常控制在80-300 bp,為了保證擴增效率，在設計引物時要考慮PCR產物的長度。
6）引物3′端末端盡量避免為A，引物3′端錯配時，不同堿基引發效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。
7）堿基要隨機分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。
8）引物自身及引物之間避免存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′ 端的互補重疊以防止引物二聚體的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其DG值不要過高（應小于4.5 kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行。
5. 異常結果分析
無Ct值出現
采集熒光信號的步驟有誤：在退火/延伸結束采集信號；
引物降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；
模板量不足：對未知濃度的樣品應從原液開始測試；
模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
Ct值偏大 (Ct >35)
擴增效率低：反應條件不夠優化，引物設計存在問題，可試用三步法進行反應，也可適當降低退火溫度等；
PCR產物太長：一般采用80-150bp的產物長度。
3) 標準曲線線性關系不佳
a. 加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；RNA模板推薦使用1×TE緩沖液（Cat #60143ES）進行梯度稀釋，DNA模板推薦使用ddH2O稀釋;
b. 標準品出現降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品；
c. 引物設計不佳：重新設計引物；
d. 模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
4) NTC有擴增（Ct<32）
a. 引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現；
b. 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比；
c. 氣溶膠污染：擴增產物泄露很容易在實驗室中引發氣溶膠污染，一旦污染，定量檢測結果就會不準確。推薦使用DNA/RNA Remover 核酸氣溶膠污染清除劑（Cat #19702ES）。
注意事項
1. 本產品僅作科研用途。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
3. 加樣和配液步驟都盡量在冰上操作。
4. 每個組分在使用前都應震蕩混勻，低速離心。
