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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,制藥 |
|---|
產品介紹
產品簡介
潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產生的一種氨基糖苷類抗生素，通過干擾70S核糖體易位和誘導對mRNA模板的錯讀而抑制蛋白合成，從而殺死原核（如細菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳動物真核細胞。
大腸桿菌（ Escherichia coli.）來源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），編碼潮霉素B磷酸轉移酶，將潮霉素B轉化成不具有生物活性的磷酸化產物，從而起到解毒作用。針對這一原理，潮霉素B是一種非常有用的選擇性標記，用來篩選和維持培養成功轉染潮霉素抗性基因的原核或者真核細胞。另外，由于作用模式的差異，常與G418 (Geneticin)，Zeocin和Blasticidin S聯合使用進行雙抗性陽性細胞株的選擇。潮霉素B還能用作抗病毒劑，因其選擇性滲透進入因病毒感染增強通透性的細胞，且具有抑制翻譯的功效。還可混合入動物飼料中起到驅蟲功能。
產品信息
貨號 | 60225ES03 / 60225ES10 |
規格 | 1 g /10 g |
CAS號（CAS NO.） | 31282-04-9 |
分子式（Molecular Fomular） | C20H37N3O13 |
分子量（Molecular Weight） | 527.52 g/mol |
純度（Purity） | ＞90% by HPLC |
溶解性（Solubility） | 易溶于水 |
活力（Potency） | ≥1050 U/mg |
結構（Structure） |
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組分信息
組分名稱 | 60225ES03 | 60225ES10 |
規格 | 1 g | 10 g |
儲存條件
-25~-15℃保存，有效期2年。
使用說明
1. 儲存液的配制（50 mg/mL）
稱取0.5 g 潮霉素B加入10 mL 1×PBS，PH 7.4，充分溶解后用0.22 μm濾器過濾除菌，分裝成單次使用的小量（如1 mL）放到-25~-15℃凍存，1年穩定。
2. 常用篩選濃度
潮霉素B用來篩選穩轉株的工作濃度需要根據細胞類型、培養基、生長條件和細胞代謝率而變化，推薦使用濃度為50-1000 μg/mL。對于第一次使用的實驗體系建議建立殺滅曲線（kill curve），即劑量反應性曲線，來確定最佳篩選濃度。
一般而言，哺乳動物細胞50-500 μg/mL；細菌/植物細胞20-200 μg/mL；真菌300-1000 μg/mL。
3. 殺滅曲線的建立
為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素濃度，可通過建立殺滅曲線（劑量反應曲線）來實現，至少選擇5個濃度。
1）第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO2培養過夜?！咀ⅰ浚簩τ谛枰呙芏葋頇z測活力的細胞，可增加接種量。
2）根據細胞類型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例，可設定50，100，250，500，750，1000 μg/mL。先用去離子水或者PBS buffer按照1:10的比例將母液稀釋到5 mg/mL，然后按照下表稀釋到相應濃度的工作液。
終濃度（μg/mL） | 培養基體積（mL） | 5 mg/mL潮霉素B加入體積（mL） |
50 | 9.9 | 0.1 |
100 | 9.8 | 0.2 |
250 | 9.5 | 0.5 |
500 | 9.0 | 1.0 |
750 | 8.5 | 1.5 |
1000 | 8.0 | 2.0 |
3）第二天：替換舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個濃度做三個平行孔。
4）接下來每3-4天更換新的含藥物培養基。
5）按照固定的周期（如每2天）進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數（通常是7-10天）內能夠殺死絕大多數細胞的濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。
4. 穩定轉染細胞的篩選
1）轉染48 h后，用含有適當濃度的潮霉素B篩選培養基來傳代細胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。【注】：細胞處于活躍分裂狀態時抗生素的殺傷。則當細胞過于稠密，其效率會降低。為了得到較好的篩選效果，將細胞稀釋至豐度不超過25%。
2）每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。
3）篩選7天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間，這取決于宿主細胞類型，轉染，以及篩選效果。
4）挑取并轉移5-10個抗性克隆于35 mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。
5）之后更換正常培養基培養即可。
注意事項
1. 潮霉素B的抗性基因（hyg或hph）除了來自E. Coli.外，還發現于其他的菌株，包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3. 本產品僅用于科研用途，禁止用于人身上。
