Hieff NGS® eTAPS酶法DNA甲基化轉化試劑盒

產品信息

產品描述

Hieff NGS^® eTAPS Enzymatics Methyl-seq Conversion Module是翌圣生物科技（上海）股份有限公司開發的一款高效DNA甲基化位點轉化試劑盒（eTAPS技術），可以將甲基化的胞嘧啶（5mC）特異性地轉化成尿|嘧|啶（U）。最終，eTAPS技術可以高效特異性地將甲基化的胞嘧啶（5mC）轉變成胸腺嘧啶（T），通過C>T突變來實現單堿基分辨率和高準確性的DNA甲基化正向篩選和鑒定，適用于1-200 ng起始量的DNA樣本。本試劑盒流程包括eTET酶氧化、轉化劑轉化和磁珠回收三個步驟，具有轉化效率高、操作簡便、特異性好、回收率高等優點。

產品組分

運輸與保存方法

干冰運輸。效期一年。-20℃保存，切不可搞錯！

注意事項

一、 關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離；配備文庫構建專用移液器等設備；定時對各實驗區域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環境的潔凈度。

5. 本產品僅用作科研用途！

二、應用范圍

本試劑盒適用于DNA甲基化（DNA 5mC）研究，針對的DNA投入量為1-200 ng，也提供了應用于RNA 甲基化（RNA 5mC）的可能性。

三、關于DNA材料

1. 請不要用包含EDTA的緩沖液溶解DNA材料。若溶解DNA的緩沖液中包含EDTA，我們推薦先進行NGS建庫，在PCR擴增前再使用本試劑盒進行DNA甲基化轉化。

四、關于試劑和操作注意事項

1. eTET1為二價金屬依賴性DNA雙加氧酶，因此對氧化體系中EDTA較為敏感。請不要用包含EDTA的緩沖液溶解DNA材料。若使用EDTA的緩沖液溶解DNA材料，我們建議進行一輪DNA回收進行純化，或者對eTET1 Enhancer的投入量進行重新滴定，以達到eTET1最佳的氧化效果。對于DNA NGS建庫，若起始DNA溶解液較為復雜，建議先進行DNA建庫步驟（如DNA|片段化、末端修復、接頭連接和磁珠回收），使用ddH2O溶解回收的DNA，再使用本試劑盒對DNA進行eTAPS轉化，最后進行文庫擴增。

2. eTET1 Enhancer容易被氧化，收到后建議分裝保存于-20℃。短時間內不用，建議-80℃保存。

3. Conversion Enhancer有輕微揮發性和刺激性，使用時請保證操作環境通風，并戴好口罩和防護眼鏡。

4. Neutralizer具有強堿性，在使用過程中請做好防護。滴到皮膚上，應先用干凈布拭去，然后用大量水清洗，最后涂抹稀硼酸稀溶液。滴到實驗臺上，用濕抹布擦去即可。

5. 2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反應液，主要用于eTAPS轉化后DNA的擴增。在NGS建庫過程中，請用此酶代替建庫試劑盒中的擴增mix，以保證更高效的文庫擴增和保真性。若使用轉座酶法建庫，則無須進行擴增mix的替換。

五、關于DNA甲基化標準品

Specific Methylated Site DNA使用的是一段人工合成的DNA|片段，片段上包含三個DNA甲基化位點，兩個甲基化位點主要用于評判eTAPS的轉化效率。序列如下(下劃線堿基C即為甲基化的C)：

AGTGACGCATGATCTGTACGATCGACCGTGCAACCCGACGCATGATCTGTACTGATCGACCGTGCAACAGCAGTCTCGATCAGCTGCTCCGCATGCAAGTAGCGGTACTAACGTACAGTACGATGCTAGCTAGTGCTTAGGATCGAGATCGCAGAAGGGCAAGCATTAGCTATCGATCGAGCACTACTAGCTAGCATCCGATCGATCATCGTCACGGTACGTCCAGC。

Specific Methylated Site DNA的濃度為100 pg/μL，在使用過程中請根據自身DNA投入量進行添加。我們推薦的投入DNA和Specific Methylated Site DNA比例為100-1000:1。

六、自備材料

1. DNA回收：我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)進行DNA回收，也可以使用柱回收和

AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行代替。

2. DNA建庫試劑盒：我們推薦使用以下DNA建庫試劑盒進行illumina或者MGI文庫的構建：

全能型DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12199、12200、12201、13310)

一步法DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12203、12204、12205、13321、13322)

單鏈DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12211)

3. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀、恒溫震蕩儀等。

使用方法

一、操作流程

圖1.eTAPS酶法DNA甲基化轉化試劑盒原理示意圖和建庫操作流程

二、操作步驟（操作前請仔細閱讀操作注意事項）

2.1 eTET1酶處理

1. 將表1中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用（eTET1 Enhancer解凍混勻后放置在冰上）。

2. 于無菌PCR管中配制表1所示反應體系。

表1 eTET1氧化反應體系

3. 37℃反應1.5 h。加入1 μL Termination Buffer和1 μL Termination Enzyme。（若為了更好的轉化效果，此處可以將PCR管放在PCR儀中50 ℃處理 10 min）。

2.2 轉化劑處理

1. 將表2中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表2所示反應體系。

表2 轉化劑處理反應體系

【注】：Conversion Enhancer和Reagent需要單獨添加，請不要提前混成mix。

3. 37℃反應14-18 h（混勻后可以在PCR儀中反應，熱蓋50℃）。

4. 反應結束后，加入22 μl Neutralizer，混勻。

2.3 磁珠回收

1. 加入120 μL室溫下平衡的DNA Selection Beads，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置孵育10-15 min。

2. 短暫離心（<100×g），將離心管置于磁力架上靜置3 min，待磁珠*貼壁后吸除PCR管中溶液。保持PCR管始終處于磁力架中，從另一側加入200 μL 80％乙醇，避免直接沖刷磁珠，靜置60 s。吸除液體，保持PCR管始終處于磁力架中，再次加入200 μL 80％乙醇，靜置60 s。吸除干凈液體，保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過3 min）。從磁力架上取下PCR管，加入21 μL ddH2O，并充分渦旋。室溫靜置5 min。

3. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移20 μL上清至干凈的管中，于-20℃保存。

2.4 DNA建庫

按照推薦的試劑盒說明書進行文庫構建。我們推薦使用以下DNA建庫試劑盒進行illumina或者MGI文庫的構建：

全能型DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12199、12200、12201、13310)

一步法DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12203、12204、12205、13321、13322)

轉座酶DNA建庫試劑盒（Yeasen Cat#12206、12207）

單鏈DNA建庫試劑盒(Yeasen Cat#12211)

【注】2 × HiFi Uracil Plus PCR Mix是耐尿|嘧|啶的超高保真DNA聚合酶反應液，主要用于eTAPS轉化后DNA的擴增。在NGS建庫過程中，請用此酶代替建庫試劑盒中的擴增mix，以保證更高效的文庫擴增和保真性。

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