產品信息

產品描述

Hieff NGS^® DNA&RNA Library Co-Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina^®測序平臺的DNA&RNA測序文庫構建試劑盒，包含RNA反轉錄試劑，常規dscDNA合成試劑，DNA---片段化試劑，接頭連接試劑，以及文庫擴增試劑。本產品利用專業開發設計的新一代片段化酶可以完成DNA和RNA一管式建庫，簡化了操作流程，極大的降低了建庫時間和成本。本試劑盒具有優秀的文庫轉化率，可應用于mNGS樣本，腫瘤樣本，復雜樣本等的建庫。經測序驗證，不同GC含量的樣本，均可獲得優異的測序結果，文庫覆蓋度高，均一性好，偏好性低，使建庫變得更加簡單高效。提供的所有試劑都經過嚴格的質量控制和功能驗證，保證了文庫構建的穩定性和重復性。

產品組分

組分編號和名稱			12299ES05	12299ES24	12299ES96
12299-A		dT23VN	5 μL	24 μL	96 μL
12299-B		Random Primer	5 μL	24 μL	96 μL
12299-C		1st Reaction Buffer	40 μL	192 μL	768 μL
12299-D		1st Strand Enzyme Mix	10 μL	48 μL	192 μL
12299-E		2nd Reaction Buffer	35 μL	168 μL	672 μL
12299-F		2nd Strand Enzyme Mix	15 μL	72 μL	288 μL
12299-G		Smearase Buffer	50 μL	240 μL	960 μL
12299-H		Smearase Enzyme Mix	25 μL	120 μL	480 μL
12299-I		Ligation Enhancer	150 μL	720 μL	2×1440 μL
12299-J		Novel T4 DNA Ligase	25 μL	120 μL	480 μL
12299-K		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	125 μL	600 μL	2×1200 μL
12299-L		Primer Mix	25 μL	120 μL	480 μL

運輸與保存方法

干冰運輸。-20℃保存。有效期1年。

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

4. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區域定期進行清理，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離；配備文庫構建專用移液器等設備；定時對各實驗區域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧），以保證實驗環境的潔凈度。

二、關于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 本公司可提供長接頭（Indexed Adapter）試劑盒和短接頭（也稱為小Y接頭、不完整接頭）試劑盒，客戶可根據實驗需求進行選擇。

目前有48種Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 （Cat#12414~Cat#12415）。

2. 我們建議選用高質量的商業化接頭。如客戶使用自制接頭，請委托具有NGS引物合成經驗的公司，并備注需進行嚴格的防污染控制。此外，進行接頭退火操作時，請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 使用接頭時，請提前將接頭取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時，實驗室溫度最好不要超過25°C，防止接頭解鏈。

4. 建庫過程中，接頭濃度過高或過低都會導致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請根據初始的DNA或者RNA投入量，參考表1，表2對接頭進行稀釋。本公司接頭原始濃度均為15 μM，接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。

表1. Input Total RNA量與接頭使用濃度推薦表

表2. Input Total DNA量與接頭使用濃度推薦表

三、關于文庫擴增（Library Amplification）

1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真 DNA 聚合酶所組成，在第一代的基礎上，大大增強了擴增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進行無偏好性地擴增。

2. 如果您使用 Indexed Adapter（也稱為長接頭、大 Y 接頭），可使用本試劑盒提供的引物 Primer mix 進行擴增；如果使用的是“短接頭"或者叫“小 Y 接頭"，則需要使用 Index Primers 進行擴增，加上相應的 Index。

3. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足，將導致文庫產量低；循環數過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表 3 列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增，Input Total RNA 量與相應擴增循環數的推薦。

4. 表3中推薦的循環數可滿足絕大多數建庫需求，若您的樣本質量較差（如降解嚴重的FFPE樣本），可根據實際情況適當增加循環數。

表3. Input Total RNA或者DNA量與擴增循環數推薦表*

【注】：*由于文庫產量不僅與投入量和擴增循環數相關，樣本質量等都會影響產量。建庫過程中請根據實際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫條件。

四、DNA磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續文庫質量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。

6. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月。

五、關于文庫質檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物及其他不完整雙鏈結構產物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

六、自備材料（Other Material）

1. DNA純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Yeasen Cat#12601）或AMPure^® XP Beads（A63880）或其他等效產品。

2. Adapters：含Index的長接頭（Yeasen Cat#12615~12618）或者無Index的短接頭試劑盒（Yeasen Cat#12611~12612）。

3. 文庫質檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產品；文庫定量試劑。

4. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

建庫流程圖

 圖1.DNA& RNA共建庫操作流程

使用方法

Step 1 RNA變性

1. 將 Dt23VN、Random Primer 室溫解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。按照下表配置反應液：

表4. RNA預變性反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表5所示設置反應程序，進行RNA的預變性。

表5.第一鏈cDNA合成反應程序

Step 2 第一鏈cDNA的合成（1^st Strand Synthesis）

1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出，室溫解凍，顛倒混勻后瞬離。按表6所示，配制第一鏈cDNA合成的反應液。

表6.第一鏈cDNA合成反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表7所示設置反應程序，進行第一鏈cDNA的合成。反應結束后立即進行第二鏈cDNA的合成。

表7.第一鏈cDNA合成反應程序

Step 3第二鏈cDNA的合成（2^nd Strand Synthesis）

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出，解凍后顛倒混勻；按照表8所示，配制第二鏈cDNA合成反應液。

表8.第二鏈cDNA合成反應體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻，瞬離將反應液離心至管底。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表9所示設置反應程序，進行第二鏈cDNA的合成。

表9.第二鏈cDNA合成反應程序

Step 4 DNA---片段化/末端修復/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將DNA---片段化，同時進行末端修復及dA尾添加。

1. 將表10中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表10反應體系。

表10. DNA---片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表11所示反應程序，進行DNA---片段化，末端修復及dA尾添加反應。

表11.DNA---片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應程序

【注】：*DNA---片段化過程為有效控制片段化效果，避免過度酶切，反應程序可預先設置4°C，待模塊溫度降至4°C時，將PCR管放入PCR儀即可。**對于完整的基因組DNA，酶切時間參考表12。

表12.片段化時間選擇表

 圖2. 不同片段化條件下的文庫峰形

Step 5 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟可在末端修復和dA尾添加的產物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 參考注意事項二中的表1或表2，根據Input DNA或RNA量，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表13中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.3步驟結束后的PCR管中繼續配制表13所示反應體系。

表13. Adapter Ligation體系

【注】：*Ligation Enhancer使用前請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時離心后使用。

**本公司接頭原始濃度為15 μM, 請根據注意事項二表1或表2的提示，根據投入量對接頭進行稀釋，使接頭添加體積固定為5 μL。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表14所示反應程序，進行接頭連接反應：

表14. Adapter Ligation反應程序

Step6連接產物純化（Post Ligation Clean Up）

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進行PCR擴增。

Step 7 文庫擴增（Library Amplification）

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產物進行PCR擴增富集。

1. 將表15中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表15所示反應體系。

表15.短接頭連接產物PCR反應體系

【注】：*如果使用的是無Index的接頭，俗稱短接頭（小Y接頭），請使用短接頭試劑（Cat#12611~ Cat#12612，Cat#12414~ Cat#12415，）中配備的Index primer進行擴增。

**如果您使用的是Indexed Adapter（Cat#12615~ Cat#12618），俗稱長接頭（大Y接頭），可用試劑盒中的Primer Mix進行擴增；

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表16示反應程序，進行PCR擴增。

表16.PCR擴增反應程序

Step 8 擴增產物磁珠純化（Post Amplification Clean Up）

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取45 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）至Adapter Ligation產物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，進行文庫定量、質檢。

Step 9 文庫質量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項五。

HB210701