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Rhod-2, AM,Cell Permeable 細胞可滲透鈣離子熒光探針

產品信息

產品描述

Rhod-2是一種可見光激發的高親和力Ca²⁺指示劑，與其他可見光激發熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現象的細胞和組織內鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖鈣離子螯合劑光激活導致的鈣離子釋放。

與紫外光激發的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發Ca²⁺探針具有以下特點：1）可被大多數設備的激發器有效激發，包括共聚焦激發掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。2）具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca²⁺變化，從而降低了對活細胞的光毒性。3）Ca²⁺依賴性熒光強度增強，對Ca²⁺變化水平檢測敏感度更高。4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。5）兼容光激活探針以及UV-激發試劑，因此更方便于多參數檢測。5）無光譜偏移。

產品性質

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃避光干燥保存，有效期6個月。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

需要試劑準備

1） （可選）配制Pluronic F-127母液：100 mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30 min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）Hanks•balanced salt solution

使用方法（本實驗方案僅供參考，為得到實驗結果，需根據具體的實驗情況優化實驗條件。）

1）Rhod-2/AM儲存液的配制

利用高質量無水DMSO溶解Rhod-2/AM配制成2-5 mM的儲存液，該儲存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存。每次使用前需回溫至室溫。

【注】：① 因為Rhod-2/AM在水中的溶解性和穩定性較差，不可用水溶性緩沖液配制Rhod-2/AM儲存液。

② 溶解用的DMSO需要保證新鮮無水，否則將會導致AM 體水解，使熒光染料無法進入細胞，影響實驗效果。

2）Rhod-2/AM工作液的配制

利用合適緩沖液(如Hanks & Hepes )將Rhod-2/AM稀釋成1-10 μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 µM工作液，用1 mL 緩沖液稀釋4 µl 1mM母液即可，混勻。

【注】：① 典型工作液濃度為0.1-5μM，對于大多數細胞，我們推薦加載濃度4-5 μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用低探針濃度。

② Rhod-2/AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3）（可選）如果Rhod-2/AM進入細胞的效果不好，可向 Rhod-2/AM/DMSO 儲存液中加入適量20% Pluronic F127溶液，終稀釋至其終濃度為0.02-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Rhod-2/AM在緩沖液中聚合并能幫助其進入細胞。

【注】：Pluronic F127可降低Rhod-2/AM的穩定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議將其加入儲存液長期保存。

4）取出預培養的細胞，除去培養基，使用緩沖液洗滌細胞3次。

【注】：如果使用含血清的培養基，血清中的酯酶會分解 AM 體，從而降低Rhod-2/AM進入細胞的效果。另外含有酚紅的培養基會使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養基殘留。

5）將 Rhod-2/AM工作液加入細胞，加入量以覆蓋細胞為準。在37℃培養15-60 min，然后除去Rhod-2/AM工作液。

【注】：關于孵育的時間，如果*做實驗不能確定，建議先孵育30 min，看熒光效果：如果細胞死亡較多，適當縮短時間；如果熒光強度太弱，適當延長時間。

6）用不含探針緩沖液洗滌細胞 3 次，以充分去除殘留的Rhod-2/AM工作液。然后加入緩沖液覆蓋細胞。

7）37℃培養箱孵育約 20-30 min，以確保 AM 體在細胞內的*去酯化作用。

8）流式細胞儀檢測細胞。

【注】：① 某些細胞會將熒光探針被動運輸或分泌到胞外，在一些通過陰離子泵泄漏探針的細胞內該現象尤其嚴重，此時需加入一些抑制劑防止該情況的發生，如加入適量的丙磺舒或磺吡酮。但需注意，抑制劑的加入量必須經過優化，過量的抑制劑也會對細胞造成不利影響。

② 某些細胞具有自體熒光會影響結果分析，需使用未加載探針細胞做對照，在結果分析時在同一波長下扣除自熒光。

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