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產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR試劑盒 | 10186ES50 | 50 T | 323.00 |
Animal Blood Direct PCR Kit (With Dye) 全血直接PCR試劑盒 | 10186ES70 | 200 T | 983.00 |
產品描述
全血直接PCR試劑盒是一款可以直接對全血樣本進行PCR擴增的試劑盒，無需DNA提取或樣品處理，大大降低了污染風險，縮短了檢測時間。
試劑盒中包含配方優化的2× Blood Master Mix，具有很強抑制物耐受性，人血的模板大加入量可達45%，鼠血的可達20%，可以靈敏的擴增血液樣本中基因組和外源目的DNA篇段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，擴增產物末端加A，適用于Hieff Clone®快速克隆試劑盒（貨號：10907ES60/10908ES60）。
該試劑盒可用于直接擴增的血樣類型包括：新鮮血液、4℃貯存血液、冷凍血液以及儲存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干xue漬，且兼容所有常規抗凝劑（EDTA、檸檬酸鹽、肝素等）。適用樣本來源包括人血、鼠血、雞血、鳥血、牛血、狗血等。
產品組分
編號 | 組分 | 產品編號/規格 | |
10186ES50（50T） | 10186ES70（200T） | ||
10186-A | 2× Blood Master Mixa | 500 µL | 1 mL× 2 |
a）2× Blood Master Mix：包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、PCR反應增強劑、優化劑以及穩定劑等，產品已混合溴酚藍染料（不含SDS），PCR產物可以直接進行電泳。
運輸和保存方法
冰袋運輸。-20℃保存。避免反復凍融。
操作方法
1. PCR反應體系配制
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Blood Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
抗凝全血 | X | X | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】：使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a）模板使用量：進行基因組上的目的片段檢測，建議使用少量的血液量作為模板；檢測血液樣本中某種病毒或細菌等的目的片段，建議擴大PCR體系并使用較大量的血液模板。血液模板多占PCR體系的45%（人血）、20%（鼠血）。若模板使用含有血液的采集卡，可截取直徑1-4 mm的血點，直接加入20-50 μL PCR反應體系進行擴增。
b）引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-0.5 μM之間進行調整。
c）反應體系：推薦使用20 μL或 50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
d）體系配制：配制好PCR反應體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應液集于管底。
2. PCR反應條件設置
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 5 min | 1 |
變性 | 95℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50℃～65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
終延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】： a）預變性：95℃，5 min可以讓白細胞裂解，釋放可用于PCR擴增的基因組DNA。請勿縮短時間或降低溫度。
b）退火溫度：退火溫度設置為引物Tm值即可。然而，使用高的退火溫度可以有效減少非特異性擴增，并提高全血模板的擴增效率。因此，如擴增產物特異性較差，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板適退火溫度。
c）延伸時間：按30 sec/kb設定，如不足30 sec，設置30 sec即可。
d）擴增循環數：35個循環已可以擴增足量產物。太多的循環將會導致非特異性擴增增加。
3. 擴增產物分析
PCR完成后，建議將反應液于1000× g (大約4000 rpm) 離心1～3 min以沉淀血細胞碎片，之后取上清進行下游分析。該步驟可有效去除多種血液組分。當使用高濃度血液模板時此步尤為重要，因為經過PCR循環，反應管中會存在大量的血細胞碎片。這些碎片會干擾下游的檢測，如瓊脂糖電泳檢測。注意：由于血液本身的原因，PCR 結束后在 PCR 管的底部會出現透明凝膠狀物質，此為正常現象。
4. 對照反應
在PCR結果分析時，不管是陽性結果或陰性結果，如果沒有對照反應，都不能確定結果是否可靠。為了便于后續實驗結果的分析，建議在進行PCR時，設置陽性和陰性PCR對照反應以便于排除假陽性或假陰性的干擾。
4.1 陽性對照反應體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Blood Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2 μM |
模板DNA | X | X | 100-200 ng |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】：a）模板DNA：選用樣本純化的DNA。
b）引物的選擇：建議選擇該樣本較易擴增的基因的引物，如 β-actin 基因或 GAPDH 等。
4.2 陰性對照
PCR反應體系被污染會導致PCR結果出現假陽性，需要設置陰性對照來排除。將使用的移液器槍頭浸泡在2× Blood Master Mix中，添加引物，ddH2O進行PCR擴增；另取ddH2O作為模板，用目的基因引物進行PCR擴增，以排除PCR體系是否被污染和實驗是否有其他污染源。
注意事項
1. 盡量使用新鮮抗凝血。若凍存血，應避免反復凍融。
2. 解凍后2× Blood Master Mix可能出現渾濁，冰上放置1-2 min，待溶液澄清后，上下顛倒混勻，不影響試劑性能。
3. 建議擴增片段長度1 kb以內，以便擴增效率*。
4. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
常見問題與解決方法
常見問題 | 可能原因 | 解決方法 |
陽性對照、待測樣本均無條帶。 | PCR反應體系或反應條件不合適。 | 使用梯度PCR摸索PCR*反應條件。 |
PCR試劑保存不當失去活性。 | 2× PCR Mix應保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。 | |
引物設計問題。 | 嘗試重新設計引物進行檢查。 | |
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。 | 血液樣本保存不當，基因組DNA降解。 | 抗凝全血可在4℃保存2-8天，需長時間保存可將樣本置于在-20℃或-70℃凍存，并避免反復凍融。 |
模板加入量不適合。 | 可在PCR體系10%-30%范圍內優化血液加入量；若是擴增血液樣本中的病毒或細菌DNA篇段，可將模板量增加至30%-40%。 | |
PCR循環數不足。 | 適當增加PCR的循環數，推薦在35-40循環為佳。因為模板復雜，一般PCR反應要比用純化的 DNA模板多5-10個循環為佳。 | |
非特異性擴增 | PCR退火溫度太低，循環數、引物濃度或模板濃度太高。 | 增加PCR退火溫度，降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。 |
PCR引物錯配。 | 重新設計PCR引物。 | |
配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。 | PCR反應體系的配制在低溫下進行，配制完成后盡快進行PCR擴增反應。 | |
陰性對照出現目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。 |
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