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產品信息

產品描述

本試劑盒是利用拓撲異構酶（Topoisomerase）高效快速連接DNA-------片段的原理進一步研發而成，與傳統的T4連接酶相比，具有以下優勢：1）快速，僅需1-5分鐘即可完成連接反應。2）高效，無自連現象，陽性克隆率接近100%，無需設置藍白斑篩選；3）操作簡單，從連接到涂板僅需15-20 min。操作過程省去冰浴、熱激和1 h復蘇。4）可連接長達5 kb目的產物。

產品用途

平末端PCR產物的快速克隆。

克隆后PCR產物的快速測序（使用M13F/M13R引物）。

產品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，避免反復凍融。有效期一年。

注意事項

1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2）本產品僅作科研用途！

使用方法

一、Control DNA 片段的克隆實驗

1）在無菌微量離心管中配制下列DNA溶液，以10 μL為例。

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應5 min。

【注】：連接反應不可于冰上進行。反應時間不要超過5 min，一般1-2 min即可完成連接反應，得到足夠的重組子。

3）連接產物可直接轉化或于-20℃保存。

4）全量10 μL加入100 μL感受態細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

【注】：
a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態細胞中（加入體積不超過感受態細胞體積的1/10)。
b）通常使用商品化的感受態細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉化子，如果感受態細胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。

5）加300-500 μL LB或者SOC培養基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養10 min。

6）取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養基），培養過夜（如果預計轉化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

二、 一般DNA------片段的克隆實驗

所插入片段為平末端產物，利用高保真酶（如Canace高保真酶，Yeasen Cat#10135）擴增得到的產物如無非特異性條帶、引物二聚體可直接進行連接反應。

否則建議膠回收后使用。

【注】：
a、PCR產物不能磷酸化。

b、如擴增模板為質粒，模板質粒會在后續實驗中引起假陽性，因此推薦PCR產物進行膠回收后連接。

1）按照下表配制連接體系（以10μL為例）

【注】：
a）可根據具體實驗情況按照上述比例調整反應體系。
b）不同的插入片段所用量參考下表：

2）混勻上述體系。于室溫（20-30℃）反應5 min。

【注】：連接反應不可于冰上進行。反應時間不要超過5min，一般1-2min即可完成連接反應，得到足夠的重組子。

3）全量10 μL加入100 μL感受態細胞，輕輕混勻，室溫放置5 min。

【注】：
a）也可取5 μL連接液，加入50 μL感受態細胞中（加入體積不超過感受態細胞體積的1/10)。
b）通常使用商品化的感受態細胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5 min便可獲得足夠多轉化子，如果感受態細胞效率較低時，可以按照冰浴熱激的標準程序進行。

4）加300-500 μL LB或者SOC培養基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養10 min。
注：通常商品化的感受態細胞不超過2 kb插入片段情況下，10 min復蘇可以得到足夠多轉化子，如果感受態效率低或者插入片段長轉化子少的情況下可以提高復蘇時間到30-60 min以得到更多的轉化子。
5） 取200 μL菌液涂板（含氨芐抗性的LB或SOC固體培養基），培養過夜（如果預計轉化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100 μL，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）。

6）轉化子的篩選鑒定
a）菌落/菌液PCR鑒定；
b）質粒大小鑒定：挑取單克隆，抽提質粒后可根據質粒大小進行鑒定。
c）酶切鑒定：根據克隆實驗設計，選擇合適的限制性內切酶進行鑒定。
d) 測序分析：可選測序引物序列如下：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC
【注】：本制品陽性率相當高，一般情況下，陽性克隆率接近100%，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉化子數量也不算太少），基本就是陽性克隆，因此插入片段不超過2-3 kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個菌去測序。

pESI-blunt vector 圖譜

pESI-blunt vector sequence

ORIGIN
      1 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct
      61 gctgaagcca gttacctcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc
      121 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct
      181 caagaagatc ctttgatttt ctaccgaaga aaggcccacc cgtgaaggtg agccagtgag
      241 ttgattgtgt aaaacgacgg ccagtgtctg aggctcgctg cagtcctgaa gcttgatatc
      301 gaattcgcgt gtcgccctta agggcgacac gcgaattcga tatcgcggcc gcctgcagtc
      361 aatactgacg atggtcatag ctgtttcctg tccatagcag aaagtcaaaa gcctccgacc
      421 ggaggctttt gacttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa tgaaataaga
      481 tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga agctaaaatg
      541 agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt
      601 tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga
      661 gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa
      721 gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt
      781 attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt
      841 gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc
      901 agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga
      961 ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat
     1021 cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct
     1081 gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc
     1141 cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg
     1201 gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc
     1261 ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg
     1321 acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca
     1381 ctgattaagc attggtaatg agggcccaaa tgtaatcacc tggctcacct tcgggtgggc
     1441 ctttctgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat
     1501 cgatgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc
     1561 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc
     1621 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt
     1681 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac
     1741 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg
     1801 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca
     1861 gagtt
//
【注】：黃底為多克隆酶切位點序列


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