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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 |
|---|
產品介紹
Plant Tissue Direct PCR Kit
植物組織直接PCR試劑盒
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 |
Plant Tissue Direct PCR Kit | 10183ES50 | 50 T |
Plant Tissue Direct PCR Kit | 10183ES70 | 200 T |
產品描述
植物組織直接PCR試劑盒是一款可直接對不同類型植物葉片進行PCR擴增的試劑盒，適應性廣、穩定性強。試劑盒采用*的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解多種植物樣品并釋放出基因組DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代謝產物等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應。此外，樣品使用量少，低至1 mg植物葉片即可進行實驗。
本試劑盒中提供的2× Plant Master Mix具有很強的擴增兼容性，能直接以待測樣品裂解液為模板，進行高效特異性擴增。該試劑為2倍濃縮PCR反應混合液，包含了用于PCR擴增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
該試劑盒可用于轉基因植株鑒定、植物基因分型等。
產品組分
類別 | 編號 | 組分 | 產品編號/規格 | 儲存 | |
10183ES503（50 T） | 10183ES70（200 T） | ||||
Part I | 10183-A | Buffer P1 | 3 mL | 10 mL | 室溫或4℃ |
10183-B | Buffer P2 | 3 mL | 10 mL | 4℃ | |
10183-C | 6× DNA Loading Buffera | 1.5 mL | 1.5 mL | 4℃或-20℃ | |
Part II | 10183-D | 2× Plant Master Mixb | 500 μL | 1 mL×2 | -20℃ |
a）6× DNA Loading buffer：不含SDS。
b）2× Plant Master Mix：包含熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反應緩沖液、PCR反應增強劑、優化劑以及穩定劑等。
運輸方法
冰袋運輸。
保存方法
1. 試劑10183-A【Buffer P1】，在常溫干燥條件下，可保存12個月，如需保存更長時間可置于4℃。低溫保存，易出現沉淀，可平衡至室溫或37℃水浴10 min，待沉淀溶解后，混勻使用。
2. 試劑10183-B【Buffer P2】，中和裂解產物，使其不影響后續 PCR 反應。保存條件與Buffer P1一樣。
3. 試劑10183-C【6× DNA Loading Buffer】，可置于4℃或-20℃長期保存。
4. 試劑10183-D【2× Plant Master Mix】，-20℃保存，避免反復凍融。如果環境溫度過高，2× Plant Master Mix 可能會變渾濁，可置于冰上放置1-2 min，待溶液澄清，上下顛倒混勻3-5次后再使用。
操作方法
本試劑盒根據不同實驗需求提供了兩種操作方法。直接法僅需要將一小片植物組織加入PCR反應體系即可；裂解法則是將少量含有植物組織的裂解產物加入PCR反應體系。其中，裂解法適合目的片段較長，擴增難度較大，以及需要對同一樣本進行多次PCR擴增的實驗。
裂解法
1. 取3-5 mg葉片（直徑5-7 mm）組織，置于200 μL或1.5 mL離心管中。
【注】：切勿加入過量葉片組織，以便酶解反應更順利進行。
2. 在離心管中加入50 μL Buffer P1，確保裂解液能夠*浸沒葉片組織。
3. 蓋好離心管蓋，95℃處理10 min。
【注】：加熱后，若管壁上液體較多，可進行短暫瞬時離心。
4. 加入50 μL Buffer P2，用微量移液器吹打或者渦旋混勻。
5. 所得裂解液可4℃保存（5天）或-20℃長期保存或直接用于PCR擴增。
直接法
1. 在200 μL離心管中加入相應的2× Plant Master Mix，再添加對應的引物，并用ddH2O使其稀釋1×（PCR體系配置見下表）
2. 剪取1-2 mg葉片碎塊（直徑2-3 mm）加入配置好的1×PCR反應體系。
【注】：確保葉片碎塊*被PCR反應液浸沒，切勿加入過量組織葉片。
3. 根據優化好的PCR條件（退火溫度等）進行PCR反應。
4. 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。
【注】：建議使用試劑盒提供的6× DNA Loading Buffer，切勿使用含有SDS的Loading Buffer進行電泳。
PCR反應鑒定——PCR反應體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Plant Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解產物（DNA模板） | 4 | 10 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
【注】：各組分使用前應充分混勻。
a）模板使用量：建議10-20%總體系。避免超過總體系的30%。
b）引物終濃度：0.2-0.25 μM可以得到較好結果。反應性能較差時，可在0.1-0.5 μM范圍內調整引物濃度。
c）反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
d）體系配制：配制好PCR反應體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應液集于管底。
e）對照反應：建議進行PCR時，設置陽性和陰性PCR對照反應以便于排除假陽性或假陰性的干擾。
PCR反應鑒定——PCR反應條件
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 94℃ | 5 min | 1 |
變性 | 94℃ | 10 sec | 30-40 |
退火 | 50-65℃ | 20 sec | |
延伸 | 72℃ | 30 sec/kb | |
終延伸 | 72℃ | 5 min | 1 |
【注】：a）退火溫度：請參考引物的理論 Tm 值，退火溫度可設置低于引物理論值 2-5℃。
b）延伸時間：需要根據片段的長度來確定，對于1 kb以內的DNA片段，建議延長時間為30 sec。
注意事項
1. 本試劑盒只適合于多糖多酚含量低的植物葉片樣本，如小麥、水稻、煙草、玉米、大豆、油菜等。不適合多糖多酚含量高的植物樣本。
2. 建議使用新鮮采取的葉片組織，若為長期冷凍組織，應盡量避免反復凍融，否則會導致模板的降解，影響PCR效率。葉片組織以幼嫩為宜，若為成熟的葉片，避免使用葉片主脈部位組織。
3. 電泳檢測時，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否則，電泳時會在泳道中出現一大團拖尾亮帶，影響實驗結果。
4. 建議擴增片段長度1 kb以內，以便擴增效率*。
5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
常見問題與解決方法
常見問題 | 可能原因 | 解決方法 |
陽性對照、待測樣本均無條帶。 | PCR反應體系或反應條件不合適。 | 使用梯度PCR摸索PCR*反應條件。 |
PCR試劑保存不當失去活性。 | 2× PCR Mix應保存于-20℃，使用時避免反復凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。 | |
引物設計問題。 | 嘗試重新設計引物進行檢查。 | |
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。 | 葉片中多糖多酚含量較高，裂解混合液呈棕黃色甚至棕紅色。 | 本試劑盒不適合多分多糖含量較高的樣品。 |
裂解液、中和液加入比例不當，裂解混合液影響PCR體系的pH值。 | 正常條件下，中和后的裂解混合液的 pH 應該在7-8左右(裂解產物和Buffer P2嚴格按照1:1的量進行中和)。 | |
樣本裂解混合液保存不當或保存時間過久，DNA基因組已經降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存5天，盡量使用新制備的裂解液混合液進行PCR。 | |
模板加入量不適合。 | 在反應體系5-20%范圍內優化模板加入量。 | |
PCR循環數不足。 | 適當增加PCR的循環數，推薦35-40循環為佳。因模板復雜，一般PCR反應要比用純化的DNA模板多5-10個循環為佳。 | |
非特異性擴增 | PCR退火溫度太低，循環數、引物濃度或模板濃度太高。 | 增加PCR退火溫度，降低PCR循環數、引物濃度或模板濃度。 |
PCR引物錯配。 | 重新設計PCR引物。 | |
配制PCR反應體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。 | PCR反應體系的配制在低溫下進行，配制完成后盡快進行PCR擴增反應。 | |
陰性對照出現目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實驗所有試劑或器材均應高壓滅菌。操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。 |
樣本間交叉污染。 | 每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
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