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初級(jí)會(huì)員·12年
EnzyFluoNADP/NADPH比率熒光檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）
| 參考價(jià): | ￥ 6655 |
| 訂貨量: | 1 臺(tái) |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- EnzyFluo 產(chǎn)品型號(hào)
- BioAssay Systems 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問(wèn)次數(shù)：1356更新時(shí)間：2023-02-23 15:18:59
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 250 T |
|---|---|---|---|
| 貨號(hào) | 50140ES72 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè),制藥 |
產(chǎn)品介紹
NADP/NADPH比率熒光檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）
產(chǎn)品描述
煙|酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶Ⅰ）和煙|酰|胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，氧化型輔酶Ⅱ）是細(xì)胞中常見(jiàn)的重要輔因子，通過(guò)電子交換參與各種代謝反應(yīng)。NAD與一個(gè)磷酸分子以酯鍵結(jié)合形成NADP，NADP作為氧化劑參與光合作用。還原性輔酶II (NADPH)是NADP接受電子后的產(chǎn)物。NADPH作為供氫體可參與體內(nèi)多種代謝反應(yīng)，如：脂肪酸和核酸的合成。
NADP/NADPH比率熒光檢測(cè)試劑盒（紅色熒光）該試劑盒適用于測(cè)定NADP和NADPH，背景低，靈敏度高。NADPH可以將探針還原為高熒光產(chǎn)物，其信號(hào)可以通過(guò)熒光酶標(biāo)儀在Ex/Em = 540/590 nm或在比色測(cè)定(OD =576 nm)中定量。
產(chǎn)品組分
組分編號(hào) | 組分名稱 | 組分規(guī)格 | 儲(chǔ)存條件 |
50140-A | NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix | 2 vials | -20℃ |
50140-B | NADPH Sensor Buffer | 20 mL×1 | -20℃ |
50140-C | NADPH Standard | 1 vial (167 µg) | -20℃ |
50140-D | NADPH Extraction Solution | 10 mL×1 | -20℃ |
50140-E | NADP Extraction Solution | 10 mL×1 | -20℃ |
50140-F | NADP/NADPH Control Solution | 10 mL×1 | -20℃ |
50140-G | NADP/NADPH Lysis Buffer | 10 mL×1 | -20℃ |
運(yùn)輸和保存方法
冰袋運(yùn)輸。避光保存于-20℃，有效期1年。
注意事項(xiàng)
1 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
2 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
3 粉末溶解前請(qǐng)先短暫離心，以保證產(chǎn)品全在管底。
4 請(qǐng)勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。
5 本產(chǎn)品僅用于科研用途。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1 試劑準(zhǔn)備
① NADPH標(biāo)準(zhǔn)品母液(1 mM)：將200 μL PBS (pH 7.4)加入NADPH Standard（C組分）中制備1 mM NADPH標(biāo)準(zhǔn)品母液，用時(shí)置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復(fù)凍融。
② NADPH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(0-10 μM)：將990 μL PBS (pH 7.4)加入到10 μL NADH標(biāo)準(zhǔn)母液(1 mM)中制備10 μM NADPH標(biāo)準(zhǔn)液，然后取200 μL的10 μM NADPH標(biāo)準(zhǔn)液按照1：3的比例用PBS (pH 7.4)稀釋成NADPH梯度標(biāo)準(zhǔn)液(3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.041 μM, 0.014 μM)。
【注】：稀釋后的NADPH標(biāo)準(zhǔn)液不穩(wěn)定，應(yīng)該配置后4 h內(nèi)使用。
③ NADP/NADPH反應(yīng)液：向每瓶NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix（組分A）中加入10 mL NADPH Sensor Buffer（B組分），混勻。
【注】：相當(dāng)于125次測(cè)試的檢測(cè)用量，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。NADP/NADPH反應(yīng)液在室溫下不穩(wěn)定，注意避光盡快使用。
④ NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G）：用前恢復(fù)至室溫。
2 樣本制備
2.1 細(xì)胞樣本：收集0.5-1×107個(gè)細(xì)胞，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗后，加入100 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），37°C孵育15 min，1500 rpm室溫離心5 min，取上清檢測(cè)。
2.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗后，加入400 μL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測(cè)。
2.3 細(xì)菌樣本：4°C 10,000 g離心15 min收集細(xì)菌，每107個(gè)細(xì)菌加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫孵育15 min，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測(cè)。
2.4 植物樣本：取200 mg葉片，加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer（組分G），室溫勻漿，2500 rpm室溫離心5 -10 min，取上清檢測(cè)。
【注】：建議使用新鮮樣本，如果無(wú)法及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，樣本建議存于-80 °C，檢測(cè)時(shí)冰上解凍，但是檢測(cè)的熒光值可能會(huì)降低。不要使用RIPA裂解液，因?yàn)镽IPA裂解液會(huì)干擾檢測(cè)。如果樣本中NADPH含量高，注意稀釋樣本。
3 檢測(cè)過(guò)程
3.1 如下圖，向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADPH標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)樣本或空白對(duì)照(PBS)。
Table 1. Layout of NADPH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.
BL | BL | TS (Total) | TS (Total) | TS (NADPH) | TS (NADPH) | TS (NADP) | TS (NADP) |
NS1 | NS1 | … | … | … | … | ||
NS2 | NS2 | … | … | … | … | ||
NS3 | NS3 | ||||||
NS4 | NS4 | ||||||
NS5 | NS5 | ||||||
NS6 | NS6 | ||||||
NS7 | NS7 |
NS= NADPH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated withNADP/NADPH Control Solution , TS (NADPH) = test sample treated with NADPH Extraction Solution, then neutralized by NADP Extraction, TS (NADP) = test sample treated with NADP Extraction Solution , then neutralized by NADPH Extraction Solution
3.2 對(duì)于NADPH提取：向待測(cè)樣本中加入25 μL NADPH Extraction Solution（組分D），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP Extraction Solution（組分E）中和。
3.3 對(duì)于NADP提取：向待測(cè)樣本中加入25 μL NADP Extraction Solution（組分E），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADPH Extraction Solution（組分D）中和。
3.4 對(duì)于總NADP和NADPH：向待測(cè)樣本中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F）。
3.5 對(duì)于NADH標(biāo)準(zhǔn)液NS1-7：向NADPH標(biāo)準(zhǔn)液中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F），室溫孵育10-15 min，再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution（組分F）。
Table 2 Reagent composition for each well
Well | Reagent | Treatment | Incubate at RT 10-15 min | Treatment | Total Volume |
NS1-7 | 25 μL NADPH Standard (0-10 μM NADPH) | 25 μL F | 25 μL F | 75 μL | |
BL | 25 μL PBS (pH 7.4) | 25 μL F | 25 μL F | 75 μL | |
TS (Total) | 25 μL Test sanmple | 25 μL F | 25 μL F | 75 μL | |
TS (NADPH) | 25 μL Test sanmple | 25 μL D | 25 μL E | 75 μL | |
TS (NADP) | 25 μL Test sanmple | 25 μL E | 25 μL D | 75 μL |
3.6 每孔中加入75 μL NADP/NADPH反應(yīng)液（測(cè)試總體積150 μL），混勻后，室溫避光孵育15 min-2 h。
3.7 熒光酶標(biāo)儀下測(cè)量熒光讀值(Ex/Em = 540/590 nm)；也可以使用白色透明96孔板，使用酶標(biāo)儀在OD=576±5nm的波長(zhǎng)下讀數(shù)，但靈敏度低于熒光檢測(cè)。
【注】：高濃度的NADPH（終濃度>100 μM）會(huì)導(dǎo)致熒光讀值下降，因?yàn)镹ADPH sensor被過(guò)度氧化，生成非熒光產(chǎn)物。
數(shù)據(jù)分析
1 從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值，以獲得基線校正值，熒光背景會(huì)隨時(shí)間而增加，因此標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣本的熒光讀值計(jì)算前需減去空白孔的熒光強(qiáng)度值。然后，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程。
圖1 NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線
加入75 μL NADP/NADPH反應(yīng)液后室溫避光孵育30 min后，熒光酶標(biāo)儀下測(cè)量熒光讀值。
2 樣本中NADPH含量計(jì)算公式：NADPH concentration = (B/V)×D。B代表根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出的測(cè)試樣本中NADPH的含量(μM)，V代表測(cè)試樣本體積(μL)，D代表測(cè)試樣本稀釋倍數(shù)。
3 樣本中總NADP和NADPH含量計(jì)算公式：Total concentration = (B/V)×D。B代表根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出的測(cè)試樣本中總的NADP和NADPH的含量(μM)，V代表測(cè)試樣本體積(μL)，D代表測(cè)試樣本稀釋倍數(shù)。
4 使用總NADP和NADPH含量減去NADPH來(lái)計(jì)算NADP的量。
HB221230
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