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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 1ml |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 11204ES03 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
Hieff® Hieff qPCR SYBR Green Mix(實時熒光定量) (Rox Provided Seperately) | 11204ES03 | 1 mL | 185.00 |
11204ES08 | 5×1 mL | 745.00 | |
11204ES50 | 50×1 mL | 6755.00 | |
11204ES60 | 100×1 mL | 12755.00 |
產品描述
Hieff® Hieff qPCR SYBR Green Mix(實時熒光定量) (Rox Provided Seperately)是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。Mix中含有熱啟動Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。本產品針對不同型號的實時熒光定量PCR儀，分別提供不同濃度的 Rox 參比液（High Rox/Low Rox），用于校正孔與孔之間的熒光信號誤差。
本品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化實時調節DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的線性關系。
產品組分
組分編號 | 組分名稱 | 產品編號/規格 | |||
11204ES03 （1 mL） | 11204ES08 （5×1 mL） | 11204ES50（50×1 mL） | 11204ES60（100×1 mL） | ||
11204-A | Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix | 1 mL | 5 ×1 mL | 50 ×1 mL | 100 ×1 mL |
11204-B | 50×Low Rox | 40 μL | 200 μL | 4 ×500 μL | 8 ×500 μL |
11204-C | 50×High Rox | 40 μL | 200 μL | 4 ×500 μL | 8 ×500 μL |
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。
本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR® Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
注意事項
1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
3. 本產品僅作科研用途！
反應體系（推薦冰上配制）
【注】： 使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 參比染料：Rox的添加，可根據不同儀器型號進行選擇，具體可參考【適用機型】。
b) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
c) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
d) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。
e) 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
f) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
擴增程序
三步法程序 兩步法程序
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 | 循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 | |
預變性 | 95℃ | 5 min | 1 | 預變性 | 95℃ | 5 min | 1 | |
變性 | 95℃ | 10 sec | 40 | 變性 | 95℃ | 10 sec | ||
退火 | 55-60℃ | 20 sec | 退火、延伸 | 60℃ | 30 sec★ | 40 | ||
延伸 | 72℃ | 20 sec★ | ||||||
熔解曲線 | 儀器默認設置 | 1 | 熔解曲線 | 儀器默認設置 | 1 | |||
【注】：高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。
a) 預變性時間：根據不同模板和引物的具體情況可適當縮短至2 min。
b) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。
c) 熒光信號采集（★）：請參考儀器說明書設置。
d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。
結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請提高退火溫度，或者重新設計更高特異性的引物。
引物設計指南
1）推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。
2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60oC-65oC為佳。
3）引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4）引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。
5）引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6）設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
適用機型
High Rox適用機型： ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;
Low Rox 適用機型： ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;
不需要Rox校正的儀器型號：
Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96; Thermo Scientific PikoReal Cycler;
Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR.
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