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SulfoLink Coupling Resin  巰基蛋白瓊脂糖偶聯樹脂

產品信息

產品描述

SulfoLink Coupling Resin是一類預活化樹脂，其純化原理在于可以通過與巰基或者氨基的反應實現抗原的固定化，進而利用抗原抗體的特異性反應對免疫血清中的抗體進行高效純化，是多克隆抗體生產中*的純化介質。

產品性質

運輸和保存方法

冰袋運輸。4℃保存。

注意事項

1）SulfoLink Coupling Resin使用前一定要充分顛倒若干次，使瓊脂糖珠混合均勻。

2）所有操作過程中，樣本需要在4℃或冰上操作。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

針對巰基和氨基的偶聯條件有所差異，請分別進行選擇。

1含巰基抗原的偶聯流程

1.1 緩沖液準備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用0.22 μm或0.45μm濾膜過濾。

偶聯液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5

封閉液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保護液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0

結合/洗雜液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5

1.2  抗原準備

使用偶聯液溶解抗原，制備成終濃度為 1-3 mg/ml 的抗原溶液。建議該溶液現用現配，儲存時間過長會影響偶聯效果。

【注】：① 抗原樣品使用前務必確保其巰基處于還原狀態（可以使用 DTNB(Ellman's Reagent), Yeasen Cat#60306）檢測自由巰基的含量）。如果巰基已經氧化，必須對抗原進行還原，一般推薦使用還原劑 TCEP（Tris(2-carboxyethyl)phosphine, Yeasen Cat# 20330），TCEP 溶液很穩定，可以選擇性的、高效的打開抗原中的二硫鍵，并且不影響抗原與樹脂的偶聯反應，每毫克抗原中 TCEP 的添加量不超過12mg，具體使用量需要自行優化。

② 如果使用 DTT 等含有巰基的還原劑，處理完樣品必須要將還原劑去除，否則會影響抗原與樹脂的偶聯效率。

1.3抗原偶聯

1）取適量SulfoLink Coupling Resin，加入到合適的重力柱中，靠重力流干保護液，用3倍柱體積的偶聯液平衡樹脂，待偶聯液流干，再加入3倍柱體積的偶聯液，重復操作 2遍。共使用9倍柱體積的偶聯液。

2）關閉柱子的下端出口，加入等體積的含巰基的抗原，混勻，取出至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

【注】：確保樹脂充分懸浮起來，否則將大大影響偶聯效率。

3）將上述反應體系取出，轉移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出液，再用3倍柱體積的偶聯液清洗樹脂，合并兩次流出液。

【注】：如有需要，可以使用 Ellman’s Reagent 檢測其中巰基含量，得出抗原殘留量，從而計算偶聯效率。

4）關閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，轉移至合適的離心管中，于28℃震蕩孵育30min。

5）將上述反應體系取出，轉移至重力柱中，流干其中的封閉液。

【注】：如果立即使用，可以參考【抗體純化】操作。如果以后使用，可以用3倍柱體積的結合液清洗樹脂，然后保存在等體積的保護液中，于 4℃冰箱保存。

1.4  抗體純化

1）將偶聯了抗原的樹脂裝入合適的層析柱，用5倍柱體積的結合液進行平衡，使填料處于與抗體更易結合環境中，一方面保護目標抗體，另一方面提高抗體結合效率。

2）將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸，提高目標抗體的回收率，可以控制上樣流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3）用10-15倍柱體積的洗雜液進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

【注】：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH 7.0-8.0的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱體積的結合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹脂，zui后再用5倍柱體積的保護液平衡，然后保存在等體積的保護液中，置于4℃保存，防止填料被細菌污染。

2  含氨基抗原偶聯流程

2.1 緩沖液準備

所用水和 Buffer 在使用之前建議用 0.22μm或0.45μm濾膜過濾。

偶聯液：0.1 M NaHCO₃，0.5 M NaCl，pH 8.5

封閉液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, 50 mM L-半胱氨酸，pH 8.5

保護液：20 mM PBS，20%乙醇，pH 8.0

結合/洗雜液：20 mM PBS，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl, pH 8.5

2.2抗原偶聯

1）使用偶聯液溶解抗原，制備成終濃度為5-10 mg/ml的抗原溶液。

2）取適量SulfoLink Coupling Resin，加入到合適的重力柱中，靠重力流干保護液，用3倍柱體積的偶聯液平衡樹脂，待偶聯液流干，再加入3倍柱體積的偶聯液，重復操作2遍。共使用9倍柱體積的偶聯液。

3）關閉柱子的下端出口，加入等體積的含氨基的抗原，混勻，取出轉移至合適的離心管中，置于 28℃震蕩孵育3-5h，或者4℃震蕩孵育一個晚上（12-15h）。

【注】：確保樹脂充分懸浮起來，否則將大大影響偶聯效率。

4）將上述反應體系取出，轉移至重力柱中，收集流出液，再用3倍柱體積的偶聯液清洗樹脂，合并兩次流出，待測試。

5）關閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，取出轉移至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

6）將上述反應體系取出，轉移至重力柱中，流干其中的封閉液。

【注】：如果暫不使用，可以用3倍柱體積的結合液清洗樹脂，然后保存在等體積的保護液中，于4℃保存。

2.3 抗體純化

1）將偶聯了抗原的樹脂裝入合適的層析柱，用5倍柱體積的結合液進行平衡，使填料處于與抗體更易結合環境中，一方面保護目標抗體，另一方面提高抗體結合效率。

2） 將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸，提高目標抗體的回收率，可以控制上樣流速在 0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3）用10-15 倍柱體積的洗雜液進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4）使用5-10倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

【注】：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH7.0-8.0的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進行中和，再透析。

5）依次使用3倍柱體積的結合液和5倍柱體積的去離子水平衡樹脂，zui后再用5倍柱體積的保護液平衡，然后保存在等體積的保護液中，置于4℃保存，防止填料被細菌污染。

3  SDS-PAGE 檢測

將純化抗體樣品得到的流出組分、洗雜組分和洗脫組分以及原始含抗體樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

4 問題與解決方案

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