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GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML
GST標簽蛋白純化預裝柱,5ML
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 儲存 | 價格(元) |
GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML GST標簽蛋白純化預裝柱,5ML | 20510ES08 | 5ml | 4℃ | 938.00 |
20510ES25 | 5×5ml | 4℃ | 3928.00 |
產品描述
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一種GST標簽蛋白純化樹脂,可以一步純化各種表達系統中谷胱甘肽-S-轉移酶、谷胱甘肽依賴性蛋白和谷胱甘肽重組衍生物。在結構上,該樹脂是以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為基質,通過12個原子的間隔臂,用化學方法共價結合還原型谷胱甘肽制作而成,具有更高的物理化學特性,可以耐受更高的壓力,在相對較高的流速下,實現對目的蛋白的純化,更適于工業大規模蛋白的純化。
是裝填了GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的一種中壓預裝柱,規格5ml,預裝柱具有標準接口,可以適配商品化的各類中壓色譜系統,如?KTA 等,方便客戶操作。
產品性質
基質(Matrix) | 高度交聯的4%瓊脂糖微球 |
配體(Ligand) | 通過12原子間隔臂偶聯的谷胱甘肽 |
孔徑(Bead size) | 45-165μm |
載量(Capacity) | >10mg GST protein/ml 基質(40kDa) |
zui大壓力(PressureMax) | 0.3 MPa, 3bar |
pH穩定范圍(pH range) | 3-12 |
儲存緩沖液(Buffer) | 20%乙醇 |
運輸和保存方法
冰袋運輸。4℃保存,有效期2年。
需準備試劑
所用水和Buffer在使用前用0.22μm或0.45μm濾膜過濾除菌。
結合/洗雜緩沖液:PBS,pH7.4(140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH7.4)
洗脫緩沖液:50mM Tris-HCl, 10mM 還原型谷胱甘肽,pH 8.0
【注】:結合/洗雜緩沖液或者洗脫緩沖液中可加入1-10mM DTT。
使用方法
【注】樣品在上樣前用0.22μm或0.45μm濾膜過濾,減少雜質以防阻塞柱子。
1樣品純化(以Akta為例)
1)準備:將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子,將層析柱連接至色譜系統中。再折斷下口,將預裝柱接到色譜系統中,并旋緊。
2)清洗:3-5倍柱體積去離子水沖洗層析柱中儲存液。
3)平衡:用5倍柱體積的結合Buffer平衡層析柱,使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,起到保護蛋白的作用。
4)上樣:將樣品加到平衡好的層析柱中,推薦流速1-5ml/min,保證目的蛋白與樹脂充分接觸,提高目的蛋白的回收率,收集流出液,待檢測。
【注】:樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少,也會導致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓,使得進樣器更難使用。
5)洗雜:用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗,直到紫外吸收達到一個穩定的基線,去除非特異性吸附的雜蛋白,收集洗雜液,待檢測。
6)洗脫:用洗脫Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中,通常5倍柱體積洗脫液足夠將目的蛋白洗脫下來。也可以用一個小的梯度,例如20倍柱體積或更多,來分離不同結合強度的蛋白質。
7)清洗及保存:依次使用3倍柱體積的結合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料,zui后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡,然后保存在等體積的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被細菌污染。
2 SDS-PAGE檢測
將純化過程中得到的樣品(包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等)利用SDS-PAGE進行檢測,判定其純化效果。
3 填料清洗
GST標簽蛋白純化產品可以重復使用而無需再生,但隨著非特異結合蛋白的增多和蛋白的聚集,會造成流速和結合載量性能下降,此時需對填料進行清洗。
1)去除一些沉淀或變形物質
用2倍柱體積的6M 鹽酸胍溶液進行清洗,然后立即用5倍柱體積的PBS,pH7.4清洗。
2)去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質
用3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積1% Triton X-100清洗,然后立即用5倍柱體積的PBS,pH7.4清洗。
注意事項
1)請勿冷凍保存本產品。
2)所有操作過程中,樣本需要在4℃或冰上操作。
3)為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
附表 問題及解決方案
問題 | 可能原因 | 推薦解決方案 |
柱子反壓過高 | 填料被堵塞 | 清洗樹脂。 |
裂解液中含有微小的固體顆粒,建議上樣前用0.22μm或0.45μm濾膜過濾,或離心去除。 | ||
樣品太黏稠 | 樣品中含高濃度的核酸,延長破碎時間直至粘度降低,或添加DNaseI (終濃度為5μg/ml),Mg2+(終濃度1mM),冰上孵育10-15min | |
緩沖液太黏稠 | 有機試劑或蛋白穩定試劑(如甘油等)可能會引起反壓增高,降低操作流速。 | |
洗脫組分中無目的蛋白 | GST標簽蛋白變性了 | 使用溫和的裂解條件,實驗條件以經驗為準。 |
過度的裂解使目的蛋白變性 | ||
目的蛋白聚集產生沉淀 | 在細胞裂解前溶液中加入DTT,終濃度為1-10mM | |
融合蛋白改變了GST的構象,影響了目的蛋白的結合力 | 測定pGEX中GST的結合力,對載體進行超聲處理,檢測其結合力。如果載體中GST有很高的親和力,有可能是改變融合蛋白的構象從而降低了GST標簽蛋白的親和力。 | |
降低結合溫度至4℃,充分清洗。 | ||
柱子平衡時間太短,目的蛋白不是在pH6.5-pH8.0范圍內結合 | 用pH6.5-pH8.0的buffer進行充分的平衡,如PBS. | |
目的蛋白沒有*洗脫下來 | 洗脫體積太少 | 增加洗脫液體積,減小洗脫流速。 |
洗脫液中谷胱甘肽濃度太低 | 增加洗脫液中谷胱甘肽濃度,可嘗試用50mM Tris-HCl, 20-40mM還原型谷胱甘肽pH8.0洗脫 | |
低pH影響洗脫 | 在不增加洗脫液中谷胱甘肽量時,提高洗脫液中pH至pH8-9會有改善 | |
增加洗脫液中離子強度,如0.1-0.2M NaCl | ||
洗脫液中谷胱甘肽被氧化 | 使用新鮮配制的洗脫液 | |
加入DTT | ||
非特異性疏水作用影響目的蛋白的溶解和洗脫 | 洗脫液中加入非離子型洗滌劑,如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
電泳或western blot檢測中發現多條帶 | Mr 70000蛋白與目的蛋白一起純化下來 | Mr 70000蛋白可能是大腸桿菌基因DnaK的產物,可以在目的蛋白中加入50mM Tris-HCl, 2mM ATP, 10mM MgSO4, pH 7.4在37℃加熱10min去除。 |
可通過ATP-瓊脂糖膠或離子交換來去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
GST融合蛋白已經發生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制劑,如加入1 mM PMSF | |
可能是蛋白酶對目的蛋白部分降解造成的,可使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon-或ompT) | ||
細胞破碎過度 | 減少細胞破碎時間,超聲前加入溶菌酶(菌液體積的0.1倍10mg/ml溶菌酶,25mM Tris-HCl,pH8.0),避免發泡導致蛋白酶變性,過度超聲破碎增加宿主內源蛋白與GST融合目的蛋白的共純化。 | |
共價共純化 | 包括促進蛋白正確折疊的分子伴侶的共純化,如:DnaK(Mr~70000), DnaJ(Mr~37000), GrpE(Mr ~40000), GroEL(Mr~57000), GroES(Mr ~10000) | |
抗體與E. coli的各種蛋 白反應 | 抗體吸附E. coli蛋白:GST-抗體;超聲處理去除GST抗體,可以用Western Blot檢測 |
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