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產品信息

產品描述

Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit是基于Hieff Clone™快速克隆技術的定點突變系統。使用本試劑盒，目標質粒擴增產物經DpnI消化、Hieff Clone™重組環化后直接進行轉化即可完成定點突變。該試劑盒由兩個模塊組成：Hieff® II Pfu DNA Polymerase擴增模塊和Hieff Clone®快速克隆模塊。Hieff® II Pfu DNA Polymerase超高的保真度顯著降低了擴增過程中引入新突變的可能性，其長片段擴增能力，廣泛適用于長度小于20 kb的任何質粒擴增。Hieff Clone®快速克隆系統利用高效的同源重組反應替代傳統的退火成環反應。因此使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進行DNA定點突變時，引物設計更加靈活，且擴增反應不再需要以線性方式進行，極大減少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的*降解。Hieff Clone®技術可以高效完成兩個PCR產物的無縫拼接，因此該試劑盒還能以單次擴增的方式對目標質粒上不連續的兩個位點同時進行突變。

Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit中的重組酶Exnase經過優化，專門針對單堿基、不連續雙堿基定點突變。此外，如擴增產物特異，其DpnI消化產物可不進行DNA純化而直接用于重組反應。高度優化的反應緩沖液、快捷的操作流程以及*的成功率，使得Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit成為DNA定點突變試劑盒。

應用范圍

DNA定點突變

注：如使用本品對質粒進行定點突變，請使用甲基化酶無缺陷的宿主菌 (例如Top    ⑩、DH5α、JM109)擴增原始質粒！

產品組成

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。產品-20℃保存。有效期1年。

單堿基（或連續多堿基）定點突變實驗方案

實驗流程概覽（圖一）

圖一：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進行單堿基（或連續多堿基）定點突變實驗流程

1. 引物設計

向質粒引入單堿基或連續多堿基定點突變，只需設計一對引物將質粒進行反向PCR擴增即可。引物設計基本原則為：正反向擴增引物5’端包含15-21 bp反向互補區域（GC含量40%-60%為佳），各引物非互補區域長度至少為15 bp（待突變位點至引物3’端區域Tm值高于60℃為佳）。所需引入突變可以包含在互補區域內 (需要兩條引物上均引入點突變)，也可以包含在任一條引物的非互補區域 (只需在一條引物上引入點突變)，請勿將突變位點置于引物末端。以向pUC18引入單堿基突變為例，引物設計具體方案如圖二所示。

 圖二：向質粒引入單堿基（或連續多堿基）定點突變引物設計示意圖

注：計算引物Tm值時，應計算待突變位點至引物3’端這一區域內的堿基，調整引物長度使這一段Tm值高于60℃，待突變位點至引物5’端區域內的堿基不應參與計算。

2. 目標質粒擴增

2.1 配制PCR反應體系
反應各組分解凍后請充分搖勻，使用完畢后及時放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請勿長時間敞口放置。
為了增加擴增特異性，反應體系配制過程請于冰水浴中進行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對活性降解引物，請將聚合酶最后加入反應體系中。

a. 請勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。

b. 在質粒能正常擴增的前提下，應盡量減少質粒模板使用量，推薦使用≤1 ng新鮮提取的質粒做模板。

c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應。可將Hieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進行優化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當擴增子長度大于5 kb時。

2.2 PCR擴增反應

推薦PCR反應條件：

a. 對于大多數質粒，變性溫度使用95℃即可。

b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板結合的最適溫度。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈現彌散狀。

c. 對于大多數擴增反應，延伸過程可在72℃進行。長的延伸時間有助于提高擴增產量。

d. 為了防止擴增過程中引入非目標突變，強烈建議擴增循環數≤35。如果擴增效率良好的話，推薦擴增循環數≤30。

反應結束后取少量擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。如目標質粒正確擴增，則可進行下步實驗。

3. 擴增產物DpnI消化，去除甲基化模板質粒
因上述擴增產物中包含原始模板質粒，為防止其在轉化后形成假陽性轉化子，必須在進行重組環化之前進行DpnI消化。

推薦反應體系如下：

輕輕吹打混勻后，將上述反應體系置于37℃恒溫反應1～2小時。如產物擴增特異，產物條帶單一，DpnI消化產物無需純化，可直接用于后續重組反應。如擴增不特異，DpnI消化結束后應膠回收純化目標擴增產物。

4. 重組反應

4.1 配制重組反應體系

正反向擴增引物5’端包含*反向互補的一段序列，因此在Exnase催化下擴增產物5’末端和3’末端可以發生同源重組，完成擴增產物環化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請務必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。

單點突變重組反應體系最適DNA使用量為0.03 pmol。該摩爾數對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：

DpnI消化產物最適使用量 = [0.02 × 目標質粒堿基對數] ng (0.03 pmol)

例如，向長度為5 kb的目標質粒引入單點突變，DpnI消化產物最適使用量應為：0.02 ×5000 = 100 ng。

注：DNA量太多或者太少都將降低環化效率。請務必通過瓊脂糖電泳預先確認DNA濃度，盡量嚴格按照推薦量配制反應體系。當DpnI消化產物最適使用量計算值不足50 ng或者超過400 ng時，加入50ng或400 ng即可。DpnI消化產物不純化直接用于重組反應時，使用量不應超過反應總體積的1/5，即4μl。

4.2 重組反應

1） 將上述體系置于50℃反應 20 min。

2） 待反應完成后，立即將反應管置于冰水浴中冷卻。

3） 之后，反應產物可直接進行轉化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

5. 反應產物轉化、涂板、克隆鑒定

1） 取10 μl冷卻反應液，加入到100 μl感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置30 min。

2） 42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3） 加入900 μl SOC或LB培養基，37℃孵育10min充分復蘇。

4） 37℃，200rpm-250rpm，搖菌45 min。

5） 取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養。

注: 我們推薦您使用轉化效率>108 cfu/μg的感受態細胞。如果感受態轉化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請將培養菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養基重懸后全部涂板。

不連續雙堿基定點突變實驗方案 (兩突變位點相距超過50 bp)

實驗流程概覽（圖三）

  圖三：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進行不連續雙堿基定點突變實驗流程

1. 引物設計

向質粒兩個不連續位點引入不連續雙堿基定點突變，需要設計兩對引物將質粒分為兩段進行擴增。引物設計基本原則為：在每個待突變位點處設計部分反向互補的擴增引物對。每對正反向引物5’端包含15-21 bp反向互補區域。所需引入突變可以包含在互補區域內(需要兩條引物上均引入點突變)，也可以包含在任一條引物的非互補區域(只需在一條引物上引入點突變)，請勿將突變位點置于引物末端。以向pUC18引入雙堿基突變為例，引物設計具體方案如圖四所示。

圖四：向質粒引入不連續雙堿基定點突變引物設計示意圖

注：計算引物Tm值時，應計算待突變位點至引物3’端這一區域內的堿基，調整引物長度使這一段Tm值高于60℃，待突變位點至引物5’端區域內的堿基不應參與計算。

2. 目標質粒擴增

以待突變位點A、B為界，將質粒分為AB段和BA段。使用Hieff™ II Pfu DNA Polymerase對AB段和BA段分別進行擴增。AB段擴增引物對為：待突變位點A正向擴增引物和待突變位點B反向擴增引物；BA段擴增引物對為：待突變位點B正向擴增引物和待突變位點A反向擴增引物。

2.1 配制PCR反應體系

反應各組分解凍后請充分搖勻，使用完畢后及時放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請勿長時間敞口放置。為了增加擴增特異性，反應體系配制過程請于冰水浴中進行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對活性降解引物，請將聚合酶最后加入反應體系中。
推薦反應體系如下：

a. 請勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。

b. 在各片段能正常擴增的前提下，應盡量減少質粒模板使用量，推薦使用≤1 ng新鮮提取的質粒做模板。

c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應?？蓪ieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進行優化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當擴增子長度大于5 kb時。

2.2 PCR擴增反應

推薦PCR反應條件：

a. 對于大多數質粒，變性溫度使用95℃即可。對于超過 15 kb的擴增子，變性溫度降低至92℃可以提高擴增效率。

b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板結合的最適溫度。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈現彌散狀。

c. 對于大多數擴增反應，延伸過程可在72℃進行。長的延伸時間有助于提高擴增產量。

d. 為了防止擴增過程中引入非目標突變，強烈建議擴增循環數≤35。如果擴增效率良好的話，推薦擴增循環數≤30。

反應結束后取少量擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。如目標質粒正確擴增，則可進行下步實驗。

3. 擴增產物DpnI消化，去除甲基化模板質粒
因上述擴增產物中包含原始模板質粒，為防止其在轉化后形成假陽性轉化子，必須在進行重組環化之前進行DpnI消化。

推薦反應體系如下：

將上述反應體系置于37℃恒溫反應1～2小時。如產物擴增特異，產物條帶單一，DpnI消化產物無需純化，可直接用于后續重組反應。如擴增不特異，DpnI消化結束后應膠回收純化目標擴增產物。

4. 重組反應

4.1 配制重組反應體系

AB段和BA段擴增產物末端分別包含*一致的一段序列，因此在Exnase催化下兩擴增產物末端可以分別發生同源重組，完成環化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請務必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。

不連續雙點突變重組反應體系最適DNA使用量為：較長片段0.03 pmol，較短片段為0.06 pmol。這些摩爾數對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：

較長片段DpnI消化產物使用量 = [0.02 × 片段堿基對數] ng (0.03 pmol)

較短片段DpnI消化產物使用量 = [0.04 × 片段堿基對數] ng (0.06 pmol)

例如，AB段長度為1 kb，BA段長度為5 kb。則DpnI消化產物最適使用量為：AB段0.04 ×1000 = 40 ng；BA段0.02 × 5000 = 100 ng。

注：DNA量太多或者太少都將降低環化效率。請務必通過瓊脂糖電泳預先確認DNA濃度，盡量嚴格按照推薦量配制反應體系。當DpnI消化產物最適使用量計算值不足20 ng或者超過200 ng時，加入20ng或200 ng即可。DpnI消化產物不純化直接用于重組反應時，使用量不應超過反應總體積的1/5，即4μl。

4.2 重組反應

1）將上述體系置于50℃反應 20 min。

2） 待反應完成后，立即將反應管置于冰水浴中冷卻。

3） 之后，反應產物可直接進行轉化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

5. 反應產物轉化、涂板、克隆鑒定

1）  取10 μl冷卻反應液，加入到100 μl感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置30 min。

2）  42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3）  加入900 μl SOC或LB培養基，37℃孵育10min充分復蘇。

4）  37℃，200rpm-250rpm，搖菌45 min。

5）  取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養。

注: 我們推薦您使用轉化效率>108 cfu/μg的感受態細胞。如果感受態轉化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請將培養菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養基重懸后全部涂板。

注意事項

1）引物設計時5’端反向互補區盡量選擇無重復序列，且GC含量比較均勻的區域。當這一區域內GC含量在40%～60%范圍之內時，重組環化效率將達到最大。如這部分區域GC含量高于70%或者低于30%，重組環化效率會受到較大影響。

2）當兩突變位點相距小于50bp時，應將其視為一個突變位點，將兩突變引入同一條/對引物進行實驗。

3）DpnI只能識別甲基化DNA，請務必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴增的質粒作為PCR模板。

4）長期放置、反復凍融會導致模板質粒斷裂、開環或降解，應使用新鮮制備的質粒作為模板。

5）質粒PCR擴增結果需高度特異，雜帶較多會影響實驗結果。

6）重組反應體系中應盡量避免金屬絡合劑(如EDTA)的帶入。因此，建議將DNA純化產物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常規膠回收試劑盒中的洗脫液可用pH8.0的ddH2O替代)，請勿使用TE進行DNA保存。

7）冷卻后的重組反應產物應在1h內進行轉化，且轉化前保持在冰水浴中。如需儲存，于-20℃凍存。盡量避免室溫較長時間放置或4℃長期儲存。

8）反應產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10，否則會降低轉化效率。另外，當轉化的DNA濃度太高時，會抑制轉化反應。將重組反應產物稀釋5倍后取1/5進行轉化。

9）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
10）本產品僅作科研用途！

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