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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 生物產業 |
|---|
產品介紹
Hieff CloneTM One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒
產品信息
產品名稱 | 貨號 | 規格 | 儲存 | 價格（元） | *（元） |
Hieff CloneTM One Step Cloning Kit 一步法快速克隆試劑盒 | 10905ES25 | 25T | -20℃ | 479.00 | 439.00 |
Hieff CloneTM One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10905ES62 | 5×25T | -20℃ | 2069.00 | 1869.00 |
產品描述
Hieff CloneTM One Step Cloning Kit是一款簡單、快速、高效的DNA定向克隆產品，該試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任意載體的任意位點，可高效克隆50 bp～10 kp片段。將載體在克隆位點進行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的**的序列 (15 bp～20 bp)。將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產物和線性化克隆載體按一定比例混合，在重組酶Exnase的催化下，僅需反應30 min即可進行轉化，完成定向克隆。克隆陽性率可達95%以上。克隆載體酶切產物或PCR產物和插入片段PCR產物可以不進行DNA純化直接用于重組克隆，極大的簡化了實驗步驟。
試劑盒中包含有重組反應所需緩沖液和重組酶Exnase。Exnase中添加了*的重組增強因子，顯著提高重組克隆效率，即便使用低效率感受態細胞 (107cfu/μg)也可實現高效克隆 (100cfu/ng Vector)，而且Exnase還兼容常規酶切、PCR反應體系。
該試劑盒可用于快速克隆、高通量克隆、無縫克隆和DNA定點突變。
產品組分
編號 | 組分 | 產品編號/規格 | |
10905ES25 (25T) | 10905ES62 (5×25T) | ||
10905-A | 5×CE Buffer | 100 μl | 100 μl×5 |
10905-B | Exnase | 50 μl | 50 μl×5 |
10905-C | 500 bp control insert (50 ng/μl) | 5 μl | 5 μl×5 |
10905-D | pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μl) | 5 μl | 5 μl×5 |
運輸與保存方法
冰袋（wet ice）運輸。產品-20 oC保存。
實驗流程
實驗流程概覽
1) 線性化克隆載體制備；
2) 插入片段擴增引物設計；
3) 插入片段PCR擴增；
4) 進行重組反應；
5) 反應產物轉化、涂板；
克隆鑒定。
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圖一 實驗流程概覽
制備線性化克隆載體
選擇合適的克隆位點，并對克隆載體進行線性化。推薦您盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區域進行克隆。當載體克隆位點上下游20 bp區域內GC含量均在40%～60%范圍之內時，重組效率將達到zui大。
線性化載體可通過限制性內切酶酶切（單酶切或雙酶切）或反向PCR擴增獲得。
A．酶切制備線性化克隆載體
雙酶切線性化：線性化*，轉化背景 (假陽性克隆) 低。推薦使用。
單酶切線性化：線性化程度較差。可適當延長酶切時間以降低轉化背景。
注：1）Hieff CloneTM重組反應體系內無DNA連接酶，不會發生載體自連反應。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進行末端脫磷酸處理。重組產物轉化后出現的假陽性克隆 (無插入片段) 是由未線性化環狀載體轉化而形成的。如這種假陽性克隆比例較高，應重新制備線性化克隆載體。
2）Hieff CloneTM重組反應體系兼容幾乎所有的酶切反應體系。克隆載體酶切產物加熱失活內切酶(參見內切酶使用說明書，例如Hind III，65℃孵育20 min*失活)后可直接用于重組反應。
B．反向PCR擴增制備線性化克隆載體
推薦您使用高保真聚合酶進行載體擴增 (HieffTM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60) 以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質粒，以防止殘留環狀質粒模板對克隆陽性率的影響。
Hieff CloneTM重組反應體系兼容常規PCR反應體系。因此，如擴增模板為預線性化質粒且PCR產物電泳條帶單一，擴增產物可以無需純化直接用于重組反應。
克隆載體酶切產物或PCR 擴增產物DNA 純度較低且有可能含有未線性化環狀質粒，直接使用進行重組反應時，重組效率、克隆陽性率都會有所降低。因此，在進行較大片段(>5kb) 克隆時，我們推薦您使用高質量的試劑盒對線性化克隆載體進行膠回收純化，以提高DNA 純度并去除一部分未線性化的環狀載體 (其電泳位置不同于線性化克隆載體)。不同方式制備的線性化克隆載體的使用方式可查閱表一。
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表一：線性化克隆載體的使用方式
線性化載體制備方式 | 模板類型 | 快速實驗方案 | *實驗方案 | |
酶切消化制備 | 環狀質粒 | 加入失活內切酶后直接使用 | 膠回收 | |
PCR制備 | 擴增特異 | 環狀質粒 | DpnI消化后直接使用（降解擴增模板） | 膠回收或DpnI消化后膠回收 |
預線性化質粒、基因組、cDNA | 直接使用 | 膠回收 | ||
有明顯非特異性擴增 | 膠回收 | |||
注：直接使用酶切產物或擴增產物進行重組反應時，使用體積不應超過4μl（重組反應總體積的1/5）
制備PCR產物
2.1設計擴增引物
Hieff CloneTM引物設計總的原則是：通過在引物5’端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴增產物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應的**的序列 (15 bp～20 bp)。
正向擴增引物設計方式：
5’——上游載體末端同源序列+基因特異性正向擴增序列——3’
反向擴增引物設計方式：
3’——基因特異性反向擴增序列+下游載體末端同源序列——5’
基因特異性正/反向擴增序列即常規插入片段正/反向擴增引物序列；
上游/下游載體末端同源序列為線性化克隆載體zui末端序列（用于同源重組）。
以pUC18作為克隆載體為例，引物設計方案如圖二所示。
圖二 重組引物設計方案
注：如zui終引物長度超過40bp，我們推薦您在引物合成時選用PAGE純化，可提高克隆成功率。計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算。
2.2 插入片段PCR擴增
插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 擴增，無需考慮產物末端有無A加尾 (重組過程中將被去除，在zui終載體中不會出現)。我們推薦您使用高保真聚合酶進行擴增(HieffTM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60)，以減少擴增突變的引入。
PCR結束后，取少量產物進行瓊脂糖電泳以檢驗擴增產量和特異性。Hieff CloneTM重組反應體系兼容常規PCR反應體系。因此，如擴增模板不是與克隆載體抗性相同的環狀質粒，且PCR產物電泳條帶單一，擴增產物可以無需純化直接用于重組反應。
PCR擴增產物DNA純度較低，直接使用進行重組反應時，重組效率、克隆陽性率都會有所降低。因此，在進行較大片段 (>5 kb) 克隆實驗時，我們推薦您使用高質量的試劑盒對擴增產物進行膠回收純化以提高DNA純度。插入片段擴增產物的使用方式可查閱表二。
表二：擴增產物推薦使用方式
PCR擴增情況 | PCR模板類型 | 快速實驗方案 | *實驗方案 |
擴增特異 | 與克隆載體抗性相同的環狀質粒 | DpnI消化后直接使用* | 膠回收或DpnI消化后膠回收 |
預線性化質粒、基因組、cDNA | 直接使用 | 膠回收 | |
有明顯非特異性擴增 | 膠回收 | ||
注：直接使用擴增產物進行重組反應時，使用體積不應超過4μl（重組反應總體積的1/5）
*當線性化克隆載體為酶切制備時，插入片段擴增產物經DpnI消化結束后應置于85℃加熱20 min將DpnI 失活，以避免重組反應時殘留DpnI 對克隆載體的降解。
重組反應
3.1 配制反應體系
于冰水浴中配制如下反應體系。如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心使其沉入管底。
ddH2O | Up to 20 μl |
5×CE Buffer | 4 μl |
線性化克隆載體 | 50～200 ng |
插入片度擴增產物 | 20～200 ng |
Exnase | 2 μl |
Hieff CloneTM重組反應體系zui適克隆載體使用量為0.03 pmol；zui適克隆載體與插入片段摩爾比為1:2，即zui適插入片段使用量為0.06 pmol。這些摩爾數對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：
zui適克隆載體使用量 = [0.02×克隆載體堿基對數]ng (0.03 pmol)
zui適插入片段使用量 = [0.04×插入片段堿基對數]ng (0.06 pmol)
例如，將長度為2 kb的插入片段克隆至長度為5 kb的克隆載體時，克隆載體的zui適使用量應為：0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段zui適使用量應為：0.04 × 2000 = 80 ng。
注：1) 當插入片段長度大于克隆載體時，zui適克隆載體與插入片段使用量的計算方式應互換，即將插入片段當做克隆載體/克隆載體當做插入片段進行計算。
2) 線性化克隆載體的使用量應在50～200 ng之間；插入片段擴增產物的使用量應在20～200 ng之間。當使用上述公式計算DNAzui適使用量超出這個范圍時，直接選擇zui低/zui高使用量即可。例如，插入片段長度為100 bp，zui適使用量計算值為 4 ng，實際反應體系內使用量應為插入片段擴增產物zui少使用量 20 ng。
3) 線性化克隆載體和插入片段擴增產物不進行DNA純化直接使用時，加入總體積應不超過反應體系體積的1/5，即4 μl。
4) 試劑盒中提供500 bp control insert (25 ng/μl) 和pUC19control vector, linearized (50 ng/μl) 各5 μl，需要時可進行陽性對照反應，每次反應各加1 μl。
3.2 重組反應
1) 體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻) 。
2) 置于37℃反應30 min。
3) 待反應完成后，立即將反應管置于冰水浴中冷卻5 min。
4) 反應產物可直接進行轉化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。
注：我們推薦您在PCR儀或者水浴鍋等溫控比較精確的儀器上進行反應。重組效率在反應30 min左右達到zui高，反應時間不足或者太長都將會降低克隆效率。
4. 重組產物轉化、涂板
1) 取20 μl冷卻反應液，加入到200 μl感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置30 min。
2) 42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。
3) 加入900 μl SOC或LB培養基，37℃孵育10 min充分復蘇。37℃搖菌45 min。
4) 取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃24H培養。
注：我們推薦您使用轉化效率>108 cfu/μg的感受態細胞。如果感受態轉化效率<108 cfu/μg(例如用CaCl2法新鮮制備的感受態轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間) ，請將培養菌液在5000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養基重懸后全部涂板。
5. 克隆鑒定
zui方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20～50 μl LB 培養基中混勻，直接取1 μl作為PCR模板。
我們推薦您至少用一條通用測序引物進行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產生。
將PCR陽性菌落的剩余菌液接種至含有適當抗生素的LB培養基中培養24H，提取質粒做后續的鑒定。
