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iFluor™ 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（綠色）iFluor™ 488 phalloidin

產(chǎn)品信息

背景描述                                                                                                

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動(dòng)蛋白F-actin，而不會(huì)與單體肌動(dòng)蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標(biāo)記組織切片、細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的F-actin，從而對F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動(dòng)植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個(gè)肌動(dòng)蛋白亞基約與一個(gè)鬼筆環(huán)肽分子的計(jì)量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識(shí)度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動(dòng)蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動(dòng)蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為iFluor^TM 488標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，可發(fā)出高亮度、光穩(wěn)定的綠色熒光，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。iFluor^TM 488 鬼筆環(huán)肽染色與用于細(xì)胞分析的其他熒光染色*兼容，包括熒光蛋白、Qdot® 納米晶體和其他iFluor^TM偶聯(lián)物（包含iFluor^TM偶聯(lián)二抗）。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。

本品以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。收到貨后-20℃避光干燥保存，1年有效。

注意事項(xiàng)

1. 鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量LD₅₀約2mg/kg）。

2. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

需要自備材料

1. 1×PBS緩沖液, pH 7.4, 細(xì)胞培養(yǎng)級別（貨號(hào)：60145ES76）

2. 固定液4%多聚甲醛（不含甲醇）（溶于PBS緩沖液）（貨號(hào)：36314ES60）

3. 透化液Triton X-100（溶于PBS緩沖液）

4. BSA，標(biāo)準(zhǔn)級別（貨號(hào)：36101ES25）

5. DAPI染液（即用型）（貨號(hào)：40728ES50）

操作步驟

1. 1×工作液準(zhǔn)備

吸取1µl 1000×iFluor^TM 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（溶于DMSO）到1ml 含有1%BSA的PBS緩沖液中即可得到1×工作液。

注：1）使用前需將1000×DMSO iFluor^TM 488鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)存液分裝并于-20℃避光干燥保存。

2）不同的細(xì)胞染色不同，相應(yīng)iFluor^TM 488鬼筆環(huán)肽使用量也需根據(jù)不同情況而定。

1. 染色步驟

2. 細(xì)胞培養(yǎng)24h或更長，使其密度達(dá)到50-60%匯合度。

3. 吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

4. 使用溶于PBS的4%進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10-30min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

1. 室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

2. （可選）：室溫條件下，用溶于PBS的0.1% Triton X-100溶液透化處理3-5min，從而增加其通透性。

3. 室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

4. 取足夠量新鮮配好的 iFluor^TM 488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液以覆蓋住細(xì)胞，如：100µl/孔（96孔板），室溫避光染色20-90min。

5. 用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。

6. （可選）：加入足量的即用型DAPI溶液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，如：100µl/孔（96孔板），室溫3~5min。用PBS清洗細(xì)胞2次，每次5min。

7. 于熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇iFluor^TM 488激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=493/517nm）和/或DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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