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HL50264.2 v.A

 

組織3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）合成酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書

 

主要用途

 

組織3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）合成酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在運用乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A，在HMG-COA合成酶的催化下，使烯醇式乙酰乙酰輔酶A減少致吸光峰值的降低，即采用光度法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液、微粒體，或純化酶樣品3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）合成酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。

 

技術背景

 

3-羥-3-甲戊二酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA synthase；HMGS；EC2.3.3.10）屬于酰基縮合酶（acyl condensing enzyme）家屬中的成員之一，是膽固醇通路和甲戊二羥酸通路的重要的限速酶之一，調節膽固醇、類異戊二烯脂以及酮體分子的產生，受到固醇和非固醇分子的反饋抑制。HMG-COA合成酶存在于各種動物、昆蟲、植物、真菌，以及某些細菌中。通過催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A的生物克萊森縮合反應（Claisen Condensation），生成3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA；HMG）。動物HMG-COA合成酶分成兩種亞型：線粒體型和胞漿型。線粒體型占主要，與酮體生成相關，而胞漿型與膽固醇和類異戊二烯脂生物合成相關。細菌HMG-COA合成酶與細胞壁合成、電子傳遞等有關，例如十一癸烯醇（undecaprenol）、甲萘醌（Menaquinone）和泛醌（ubiquinone）等分子合成。HMG-COA合成酶異常，會導致糖尿病酮癥酸中毒（diabetic ketoacidosis；DKA）。 基于底物乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A，在HMG-COA合成酶的催化下，縮合產生3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA），其烯醇式（enol form）乙酰乙酰輔酶A的減少，通過吸光峰值的降低變化（303nm 波長），來定量分析3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）合成酶的活性。3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）合成酶反應系統為：

 

           

                              

產品內容

 

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）        毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

反應液（Reagent D）        微升

陰性液（Reagent E）          微升

產品說明書              1份

 

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標儀：用于光度分析

 

實驗步驟

 

一、 樣品準備

 

1． 手術取出動物組織，并秤重500毫克

2． （選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗

4． （選擇步驟）抽去清理液

5． 移入到一個液氮凍存管

6． 即刻放進液氮罐過夜

7． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

8． 放進一個15毫升錐形離心管

9． 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 

10． 強力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）

12． 即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g

13． 小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管 

14． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－HL30030.1）

15． 放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

二、 測定準備

 

1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長303nm，間隔5分鐘，讀數2次（共10分鐘），并置零

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化 

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

 

三、 背景對照測定

 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 上下傾倒數次，混勻

4． 在30℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入xx微升陰性液（Reagent E）

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－10分鐘讀數）

 

四、 樣品測定

 

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 上下傾倒數次，混勻

4． 在30℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入20微升待測樣品（200微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－10分鐘讀數）

 

五、計算樣品活性

 

 

六、 酶標儀測定

 

1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升反應液（Reagent D）

4． 輕輕搖動96孔板

5． 在30℃溫度下孵育3分鐘

6． 分別加入xx微升陰性液（Reagent E）或待測樣品（200微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動96孔板

8． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和10分鐘讀數

9． 活性計算：

 

 

注意事項

 

1． 本產品為20次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議使用比色皿測定

5． 樣品須澄清，至關重要

6． 加樣后3秒內光度測定

7． 測定值由高到低變化；測定持續10分鐘

8． 光度測定后，比色皿須清洗

9． 樣本測定0分鐘讀數高于10分鐘讀數表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－HL30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度

12． 3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）合成酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內縮合產生3-羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列甲戊二羥酸（MEVALONATE）通路分析試劑產品

 

質量標準

 

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測敏感