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組織長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶活性比色法定量檢測試劑盒說明書
閱讀：681 發布時間：2023-4-12主要用途
組織長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶（KETOACYL COA THIOLASE）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用酮脂酰輔酶A作為底物，在鎂離子和輔酶A的激活下，底物解離后峰值的降低，即采用比色法來測定組織裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種組織裂解懸液樣品（動物、人體、昆蟲等）長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
脂肪酸β氧化過程（β-oxidation）在動物組織的線粒體發生的脂肪酸代謝通路，可概括為活化、轉移、β-氧化及最后經三羧酸循環被氧化生成CO2和H2O，并釋放能量等四個階段。硫解酶（Thiolase）存在于真核和原核生物的細胞里，分成兩種類型：一種為酮脂酰輔酶A硫解酶（3-ketoacyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.16），另一種為乙酰乙酰輔酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase；EC: 2.3.1.9）。酮脂酰輔酶A硫解酶又稱為硫解酶I（thiolase I），以各種鏈長脂肪酸為底物，催化脂肪酸β-氧化的最終反應，釋放乙酰輔酶A，同時產生短缺2個碳基的脂酰輔酶A。在真核生物中，酮脂酰輔酶A硫解酶又分為線粒體型和過氧化酶體型。長鏈酮脂酰輔酶A（例如酮十六脂酰輔酶A；3-ketohexadecanoyl-CoA）在長鏈硫解酶I的催化下，發生鎂-烯醇化物（Mg-enolate）的裂解，致長鏈酮脂酰輔酶A底物的減少，在分光光度儀（303nm）下，吸光值降低，來定量分析長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶的活性。長鏈酮脂酰輔酶A硫解酶反應系統為：
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
實驗步驟
一、樣品準備
1．手術取出動物組織，并秤重500毫克組織重量
2．（選擇步驟）放進預冷的15毫升錐形離心管
3．（選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗
4．（選擇步驟）抽去清理液
5．移入到一個液氮凍存管
6．即刻放進液氮罐過夜
7．次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
8．放進一個15毫升錐形離心管
9．加入置于冰槽里的500微升裂解液（Reagent B）
10．強力渦旋震蕩30秒，充分混勻
11．放進冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱里儲存備用）
12．即刻放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為10000g
13．小心移取上清液到新的無菌的1.5毫升離心管
14．移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
15．放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、測定準備
1．開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長303nm，間隔30秒，讀數5次（共3分鐘），并置零
2．從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化
3．緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、背景對照測定
1．移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入50微升反應液（Reagent D）
3．加入100微升底物液（Reagent E）
4．上下傾倒數次，混勻
5．在25℃溫度下孵育3分鐘
6．加入50微升陰性液（Reagent F）
7．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8．即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－3分鐘讀數）
四、樣品測定
1．移取800微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入50微升反應液（Reagent D）
3．加入100微升底物液（Reagent E）
4．上下傾倒數次，混勻
5．在25℃溫度下孵育3分鐘
6．加入50微升待測樣品（10微克蛋白總量）（注意：樣品須清澈）
7．上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8．即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－3分鐘讀數）
五、計算樣品活性
[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 13.5（毫摩爾吸光系數）X 3（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾酮脂酰輔酶A /分鐘
六、酶標儀測定
1．在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
2．分別移取200微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3．分別加入12.5微升反應液（Reagent D）
4．分別加入25微升底物液（Reagent E）
5．輕輕搖動96孔板
6．在25℃溫度下孵育3分鐘
7．分別加入12.5微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（10微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）
8．輕輕搖動96孔板
9．即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數和3分鐘讀數
10．活性計算：
[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.0125（樣品容量；毫升）X 13.5（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 3（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾酮脂酰輔酶A/分鐘