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細胞胱硫醚-γ-裂解酶活性光度法定量檢測試劑盒產品說明書
閱讀：870 發布時間：2022-12-5主要用途
細胞胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；CGL）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在運用胱硫醚作為底物，在裂解酶的催化下，產生半胱氨酸，使用Ellman試劑后，呈現黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產物吸光峰值的變化，即采用光度法來測定細胞裂解樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解懸液或純化酶樣品胱硫醚-γ-裂解的活性檢測，以及抑制劑篩選。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase；CGL；EC4.4.1.1），又稱為胱硫醚酶（cystathionase），是轉硫化（transsulfuration）通路中的關鍵酶之一。在細菌、真菌和植物中，為正向（forward）轉硫化，而在哺乳動物、真菌和某些細菌為逆向（reverse）轉硫化，構成含硫氨基酸半胱氨酸（cysteine）和蛋氨酸（methionine）的相互轉換，調節高半胱氨酸濃度和半胱氨酸合成，并參與谷胱甘肽合成。胱硫醚-γ-裂解酶為輔基5-磷酸吡哆醛（pyridoxal-5-phosphate；PLP）依賴性酶，催化胱硫醚（cystathionine）降解為半胱氨酸、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨；并具有催化高絲氨酸（homoserine）消去反應（elimination reaction），產生2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）、氨和水；催化胱氨酸（cystine）消去反應，產生硫化半胱氨酸（thiocysteine）丙酮酸和氨；催化半胱氨酸的消去反應，產生丙酮酸、硫化氫和氨。胱硫醚-γ-裂解酶參與硫化氫代謝通路（第三種氣體性傳導介質gasotransmitter）調節，與血管松弛、炎性反應、凋亡、缺血再灌注、氧化應激等有關。人體胱硫醚-γ-裂解酶異常，會導致胱硫醚尿癥（cystathioninuria）、胱氨酸病（cystinosis）、惡性淋巴細胞病變等疾病，對于酒精性肝損傷敏感。基于底物胱硫醚，在胱硫醚-γ-裂解酶的催化下，產生半胱氨酸、2-丁酮酸甲酯（α-ketobutyrate）和氨，進而半胱氨酸側鏈巰基與Ellman試劑5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應后，產生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長），來定量分析胱硫醚-γ-裂解酶的活性。胱硫醚-γ-裂解酶反應系統為：
產品內容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應液（Reagent D） 微升
底物液（Reagent E） 毫升
陰性液（Reagent F） 微升
顯色液（Reagent G） 微升
產品說明書 1份
保存方式
保存裂解液（Reagent B）、反應液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent G）避免光照；有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞
（微型）臺式離心機：用于樣品制備
200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析的容器
分光光度儀或酶標儀：用于光度分析
實驗步驟
一、 樣品準備
1． 準備好25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 106細胞）
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管
11． 強力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、 測定準備
1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長412nm，并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）避免光照
3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 樣品背景對照測定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升底物液（Reagent E）
3． 加入xx微升陰性液（Reagent F）
4． 加入20微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 上下傾倒數次，混勻
6． 在37℃溫度下孵育30分鐘
7． 加入xx微升顯色液（Reagent G），混勻
8． 在37℃溫度下孵育5分鐘
9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品背景對照
四、 樣品活性測定
1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升反應液（Reagent D）
3． 加入xx微升底物液（Reagent E）
4． 加入20微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
5． 上下傾倒數次，混勻
6． 在37℃溫度下孵育30分鐘
7． 加入xx微升顯色液（Reagent G），混勻
8． 在37℃溫度下孵育5分鐘
9． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數
五、計算樣品活性
六、 酶標儀測定
1． 在96孔板上做好相應標記：樣品背景對照和樣品活性
2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板的所有孔里
3． 加入xx微升陰性液（Reagent E）到樣品背景對照孔里
4． 加入xx微升反應液（Reagent D）到樣品活性孔里
5． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）到所有孔里
6． 分別加入20微升待測樣品（100微克蛋白）到所有孔里（注意：樣品須清澈）
7． 輕輕搖動96孔板
8． 在37℃溫度下孵育30分鐘
9． 分別加入xx微升顯色液（Reagent G）到所有孔里
10． 輕輕搖動96孔板
11． 在37℃溫度下孵育5分鐘
12． 即刻放進酶標儀檢測：獲得背景和樣品活性讀數
13． 活性計算：
注意事項
1． 本產品為20次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關重要
5． 測定值由低到高變化
6． 光度測定后，比色皿須清洗
7． 反應時間持續30分鐘
8． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－30030.1）
9． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
10． 可以使用胱硫醚-γ-裂解酶抑制劑DL-炔丙基甘氨酸（DL-Propargylglycine）作為抑制劑對照或陰性對照
11． 胱硫醚-γ-裂解酶單位活性定義為：在37℃，pH 8.2條件下，每分鐘內產生1微摩爾半胱氨酸所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列轉硫化（transsulfuration）通路分析試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測敏感