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人胚胎干細胞使用說明書
閱讀：1646 發布時間：2022-2-15人胚胎干細胞（hESC）說明書
貨號：4018106
規格：1×106
儲存條件：液氮儲存產品簡介：
（hESC）在無飼養層、化學成分明確、并且無動物源成分的人多潛能干細胞培養體系中培養，適合臨床級細胞研究和應用。hESC在人多潛能干細胞培養體系中可以長期穩定快速增殖，具有典型的hESC克隆形態，表達多潛能標志物基因，長期維持正常核型，并在體內外具有三胚層分化潛能。
產品內容：
組分代碼 名稱 規格 數量 儲存條件
4018106 人胚胎干細胞（hESC） 1×106 2 支 液氮
1002008 人多潛能干細胞復蘇培養基 10 mL 2 瓶 -20℃
試劑準備：
?人多潛能干細胞*培養基：室溫解凍人多潛能干細胞添加劑，吹打混勻，隨后將添加劑加入人多潛能干細胞基礎培養基形成*培養基（每0.7mL添加劑與50mL基礎
培養基混合）。人多潛能干細胞*培養基可在2 ~ 8℃穩定儲存2周。
注：人多潛能干細胞添加劑需在室溫解凍，可按實際用量對添加劑進行分裝，分裝后重新置于-80
~ -20℃保存，避免反復凍融。
細胞傳代條件：
當滿足以下條件之一時需要進行傳代：
?干細胞匯合度達到80%以上；
?干細胞集落過大，中央細胞生長不良；
?干細胞集落邊緣有開始分化的跡象。細胞傳代比例：
?通常早代次（<10代）的干細胞需要以較低的比例傳代，如1:2 ~ 1:4；成功建系的干細胞（10代以上） 可以1:6 ~ 1:10的比例傳代，傳代的比例由細胞株的生長速率決定。
?比較理想的傳代時間間隔是3 ~ 6天一次。
細胞傳代操作流程：
1.將人多潛能干細胞*培養基取出并平衡至室溫，取出包被好Matrigel的培養皿/瓶，吸去包被液并加入適量人多潛能干細胞*培養基，置于37℃恒溫CO 細胞培養箱中。
2.吸走待傳代細胞培養皿/瓶中的人多潛能干細胞*培養基，并且加入無鈣鎂的PBS溶液洗一次。
3.加入人多潛能干細胞消化液使之*覆蓋皿/瓶底。
4.37℃恒溫CO2細胞培養箱中孵育4 ~ 6分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，克隆內
部大部分細胞間出現較為明顯的間隙，肉眼觀察到細胞集落變得不透明且發白，表明細胞消化時間理想。
5.吸去消化液，即刻加入新鮮的人多潛能干細胞*培養基，用移液器扇形吹打培養皿/瓶底， 使皿/瓶底貼附的干細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻。
注：吹吸的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數總共不超過10次為宜。吹打過度導致大量單細胞出現是造成細胞分化或死亡的重要原因。
注：如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正常現象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
6.顯微鏡下觀察細胞呈4 ~ 20個細胞大小的團塊，水平十字搖勻。于室溫放置10 ~ 15分鐘。
7.顯微鏡下觀察到大部分克隆貼在皿底后將細胞置于37℃恒溫CO2細胞培養箱培養。
8.每天換液直至達到可以傳代的標準。細胞凍存
細胞凍存操作流程：
1.配制凍存液：90% 人多潛能干細胞*培養基+10% DMSO；將人多潛能干細胞*培養基取出并平衡至室溫。
2.吸走待傳代細胞培養皿/瓶中的人多潛能干細胞*培養基，并且加入無鈣鎂的PBS溶液洗一
次。
3.加入人多潛能干細胞消化液使之*覆蓋皿/瓶底。
4.37℃恒溫CO2細胞培養箱中孵育4 ~ 6分鐘，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離皿/瓶底，克隆內
部大部分細胞間出現較為明顯的間隙，肉眼觀察到細胞集落變得不透明且發白，表明細胞消化時間理想。
5.吸去消化液，即刻加入凍存液，用移液器扇形吹打培養皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的干細胞集落脫落， 輕柔緩慢吹吸混勻。
注：吹吸的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數總共不超過10次為宜。吹打過度導致大量單細胞出現是造成細胞分化或死亡的重要原因。
注：如有少量細胞無法從皿底脫落，屬于正常現象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
6.按照復蘇所需要的量，1 ~ 5×106/mL，每管1mL凍存。
7.以1℃每分鐘的速率降至-80℃過夜（一般常見商品化程序降溫盒均可提供此條件）。
8.-80℃過夜后，將凍存細胞轉移至液氮保存。細胞復蘇
細胞復蘇操作流程：
1.將人多潛能干細胞復蘇*培養基取出并平衡至室溫；取出包被過人多潛能干細胞鋪底工作液的培養皿/瓶，吸去包被液并加入適量人多潛能干細胞復蘇*培養基，置于37℃ 恒溫CO2細胞培養箱中。
2.37℃水浴解凍細胞，小心搖晃使細胞融化至僅剩一小塊冰晶，迅速取出并用75%酒精消毒凍存管外表面，轉移至無菌操作臺中。
3.將細胞懸液轉移至新的15mL離心管中，緩慢加入4mL 人多潛能干細胞*培養基，輕柔吹吸2 次混勻。
4.200g離心5分鐘。
5.棄上清，加入適量人多潛能干細胞復蘇*培養基重懸細胞，輕柔吹吸2次混勻，并接種到準備好的培養皿中，顯微鏡下觀察細胞呈4 ~ 10個細胞大小的團塊。
6.水平十字搖勻，于室溫放置10 ~ 15分鐘。顯微鏡下觀察到大部分克隆貼在皿底后，37℃恒溫CO2細胞
培養箱中培養24小時。
7.棄掉人多潛能干細胞復蘇*培養基，加入新鮮的人多潛能干細胞*培養基繼續培養，每天更換新鮮的人多潛能干細胞*培養基。
疑難解答：
?細胞復蘇率低是什么原因？
細胞復蘇需使用人多潛能干細胞復蘇培養基，可大大提高細胞的復蘇效率。復蘇過程中，轉移細胞、吹打混勻和重懸細胞時，吹打力度要輕柔，并盡量減少吹打次數，細胞接種后，即刻在鏡下觀察
細胞團塊的大小，4 ~ 10個細胞的團塊為最佳。如果吹打力度過大或次數過多，導致細胞分散成單細胞，
細胞復蘇率將偏低。
?培養基中有沉淀狀物質是否是質量問題？
添加劑在解凍過程中，會有少量沉淀析出，屬于正常現象，不影響使用，請充分混勻后與基礎培養基混合。但添加劑不能在37℃解凍，否則會析出大量沉淀，影響培養基的效價。如果培養基中出現大量沉淀， 請不要使用。
?是否能在37℃反復水浴*培養基？
不推薦。頻繁地在4℃和37℃之間轉換會導致*培養基中含有的因子失活，*培養基在使用前放置至室溫即可。
?是否能用dispase酶或者膠原酶進傳代？
在培養體系中培養的人iPSC需用非酶的溫和消化方式傳代，用dispase酶或者膠原酶消化細胞會對細胞造成傷害，影響傳代后細胞的存活率和貼壁率。
?細胞消化后成了單細胞是什么原因？
人iPSC消化成小克隆（4個以上20個以下的細胞聚集）進行傳代最為適宜，消化為單細胞會短暫影響細胞的狀態。造成細胞消化成單細胞的原因有：
1.人多潛能干細胞消化液消化過度，需減短消化時間；
2.對細胞懸液吹吸的力度過重，或次數過多，需緩慢吸液與吹液，每皿/瓶的吹吸次數控制在10次以下。
?人ESC/iPSC在傳代后不貼壁怎么解決？
造成人ESC/iPSC傳代后不貼壁的最可能的原因：
1.細胞消化時間不合適；
2.消化后吹打次數不合適，使得完成傳代后細胞集落過大或過小；
3.消化時間不合適，把細胞強行吹打下來。
?人ESC/iPSC分化怎么處理？
1.細胞在剛復蘇或傳代時，小的細胞團不呈現標準的克隆形態，培養幾天或傳代后可恢復；
2.如果人ESC/iPSC分化的表現為干細胞克隆形態良好，克隆周邊出現散在的分化細胞，可通過高比例傳代（≥1:6），使得分化細胞的密度減少，低密度的分化細胞可被培養體系篩選去除， 如未*去除，可用細胞刮或巴斯德管刮除；
3.如果人ESC/iPSC分化的表現為克隆內部松散，邊緣不平滑，在分化比例小或分化不嚴重的情況下， 可通過連續傳代2 ~ 3次恢復，如果分化嚴重，建議棄除。