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細胞因子多為多肽、蛋白或者糖蛋白，具備良好的抗原性，利用免疫學技術可以方便獲得不同細胞因子的抗血清、多克隆抗體或者單克隆抗體。細胞因子檢測無論是對免疫學、分子生物學的基礎研究，還是對闡明某些疾病的發病機理，指導臨床治療均具有重要的意義。免疫學檢測法是細胞因子檢測常用的方法之一。

 

資料表明細胞因子與疾病的病理過程密切相關，細胞因子檢測及其基因表達狀況的測定正呈上升之勢。美迪西不僅可以為客戶提供基于Bio-Plex 200、流式CBA、MSD、Luminex系統等全面進行各種single plex或multiplex的細胞因子檢測，還建立了一系列相關的免疫學檢測平臺，用于細胞因子的檢測。

 

1、細胞因子酶聯免疫吸附法ELISA檢測法

酶聯免疫吸附法ELISA是一種特殊的試劑分析方法，它是在免疫酶技術的基礎上發展起來的一種新型的免疫測定技術，其試劑易于保存、結果判斷較為客觀，是目前實驗室檢測抗原抗體經濟、普遍的試驗診斷方法。ELISA法適用于測定細胞培養上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子的水平。

 

ELISA基本原理是：

1）使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。由于酶的催化頻率很高，故可放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

3）在測定時，將待測抗體（抗原）、酶標抗原（抗體）與固相抗原（抗體）結合形成免疫復合物，經洗滌使免疫復合物與待測抗體（抗原）呈比例，加入酶反應物使其與固相上的酶反應比那的，根據顏色做定性或定量分析，得出檢測結果。

 

2、細胞因子酶聯免疫斑點（ELISPOT）檢測法

酶聯免疫斑點（ELISPOT）檢測法是基于定量夾心ELISA法原理，將刺激后的細胞滴加到包被在貼PVDF微孔中，放置于37℃孵育。在孵育的過程中，細胞分泌的細胞因子即會被包被的抗體所捕獲，最后用不溶性的酶聯底物進行顯色，每一個顯色點（斑點）代表一個分泌細胞因子的細胞。通過專用的ELISPOT分析儀或在顯微鏡下進行計數，就可以進行分析。  

 

ELISPOT法可以在單細胞水平對細胞因子（CK）分泌細胞進行檢測。由于是單細胞檢測，ELISPOT比ELISA具有更高的靈敏性，能從20萬—30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。并且該方法綜合了普通ELISA方法的高特異性和準確定量的優點，而且具有生物活性分析得出與功能相關的結果的優點。

 

3、細胞因子雙抗夾心ELISA檢測法

 

雙抗體夾心法需制備針對細胞因子不同位點的兩個單克隆抗體，先將未標記的抗體包被在酶標板上，用于捕獲抗原，再用酶標的抗體與抗原反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入酶反應底物，測定產物的吸光值，計算出捕獲的抗原量。

 

該方法可用于抗原檢測，例如細胞因子、激素、蛋白質、細菌和病毒等，是目前檢測抗原常用的ELISA方法。

 

4、細胞因子免疫印跡法Western Blot檢測法

Western Blot是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞或者組織樣本中的蛋白，經轉膜、封閉后目標蛋白與te有性一抗結合，再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的第二抗體起反應，經過底物顯色，分析曝光條帶的位置和灰度分析獲知目標蛋白在樣本中的表達情況。

 

Western Blot法結合了凝膠電泳和固相免疫測定兩種技術的高特異性和高敏感性，可以對目標蛋白進行定型和半定量的分析。通過抗原抗體反應對目標蛋白的表達進行半定量檢測，還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續分析。WB作為一種方便可靠的研究工具，將與譜和蛋白質芯片等技術一起在蛋白質組時代發揮重要作用。由于細胞因子分子量比較小，有些用Western Blot進行檢測不合適。

 

免疫學檢測法的主要特點是基于抗原抗體反應，反應簡單、快速，實驗重復性好，大量商業化試劑盒也都是基于這種檢測方法。但是，由于僅僅基于分子間免疫學反應，所測得細胞因子含量，并非等同于具備生物學活性的折疊正確的細胞因子，所以，在很多情況下需要借助于生物學檢測法最終確定細胞因子生物學活性。

 

細胞因子作為臨床和基礎研究的重要生物學分子和檢測指標，其生物活性測定方法選擇的核心依據是該細胞因子與特定靶細胞在特定培養條件下的反應性。結合免疫學方法對細胞因子含量的初步分析，并通過選取適當的體外細胞培養模型，我們才能獲得相對準確的細胞因子的生物學活性指標。

 

5、細胞因子免疫學檢驗法常見問題總結：

（1）ELISA 試 劑 盒 主 要 有 哪 些 試 劑 ？

ELISA 試劑盒中主要有

1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；

3）酶的底物；

4）標準品；

5）結合物及標本的稀釋液；

6）洗滌液；

7）酶反應終止液。

 

（2）造成ELISA測定結果不正常的因素主要有：

1）標本因素：樣本需新鮮采集，防止污染，且準確稀釋至適當的倍數。

2）試劑因素：ELISA試劑盒在保質期內，其他試劑如蒸餾水的水質等。

3）操作因素：注意操作細節，如加樣不可太快，避免加在孔壁上；洗板過程中注意洗液不能溢出孔外；顯色要注意控制時間等。

（3）ELISA 試劑盒（96 孔規格）一般可以進行多少個樣本的檢測？

 

標準品孔和待測樣本孔需進行復孔操作以保證數據的可信度。每次需將標準品按照7-8個梯度稀釋以制備準確的標準曲線。一次96孔板實驗可以進行20-25個樣本的檢測工作。

 

（4）抗體使用有哪些注意事項？

使用抗體前需仔細閱讀說明書，了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。較高濃度的抗體（>0.5mg/mL）通常性質更穩定，受生產工藝和成本控制等因素影響，不同品牌的抗體的濃度也不相同，所以購買時應注意比較，經驗不足的實驗者往往被抗體的體積迷惑，要注意相同質量下低濃度的抗體體積反而更大。

 

（5）什么是WB的灰度半定量分析？

通常用Image J 或photoshop軟件對各個樣本的目的蛋白及其內參蛋白曝光后膠片的灰度值進行計算，按照灰度值的高低來半定量分析各個樣品中蛋白的表達差異。