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【目的】

掌握BCA法測定蛋白質濃度的原理。

 

【原理】

BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他 試劑 組成的 試劑 ，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質結合時，蛋白質將Cu2+ 還原為Cu+ ，一個Cu+ 螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復合物，最大光吸收強度與蛋白質濃度成正比。

 

【操作】

標準曲線的繪制：取 試管 七支、編號，按下表操作：

 

【計算】

（一） 繪制標準曲線。

（二） 以測定管吸光度值，查找標準曲線，求出待測血清中蛋白質濃度(g/L)。

（三） 再從標準管中選擇一管與測定管光密度相接近者，求出待測血清中蛋白質濃度(g/L)。

 

【優缺點】

(一) 操作簡單，快速，45分鐘內完成測定，比經典的Lowary法快4倍且更加方便；

(二) 準確靈敏，試劑穩定性好，BCA試劑的蛋白質測定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測定范圍在0.5-10μg/ml。

(三) 經濟實用，除 試管 外，測定可在微板孔中就進行，大大節約樣品和試劑用量；

(四) 抗試劑干擾能力比較強，如去垢劑，尿素等均無影響

 

【器材】

（一） 7220型分光光度計

（二） 恒溫 水浴 箱

（三） 中試管7支

（四） 槍式移液管

 

【試劑】

1、 試劑A：1％BCA二鈉鹽

2％無水碳酸鈉

0.16%酒石酸鈉

0.4％氫氧化鈉

0.95％碳酸氫鈉

混合調PH值至11.25。

2、 試劑B：4％硫酸銅。

3、 BCA工作液：試劑A 100ml ＋ 試劑B 2ml混合

4、 蛋白質標準液：用結晶牛 血清 白蛋白根據其純度用生理鹽水配制成1.5mg/ml的蛋白質標準液。（純度可經凱氏定氮法測定蛋白質含量而確定）

5、 待測樣品：用雙縮脲測定法的樣品稀釋而成。