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干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133在肝癌中的表達(dá)及其陽性亞群增殖特性 

張寶芹(北京大學(xué)濱海醫(yī)院、天津市第五中心醫(yī)院消化科，天津市 300450)

引用本文：張寶芹. 干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD133 在肝癌中的表達(dá)及其陽性亞群增殖特性[J].中國組織工程研究，2017，21(9):1319-1323. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.002 ORCID: 0000-0002-5015-9381(張寶芹) 

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文題釋義：
CD133：是一種重要的表面標(biāo)志物，具有*的信號傳遞通路，可參與到淋巴細(xì)胞再循環(huán)過程中，與腫瘤細(xì)胞之間存在十分密切的聯(lián)系。以 CD133 為標(biāo)志物，利用其蛋白特異性特征可對不同腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分選和研究。此次實驗中，即以 CD133 為標(biāo)志物對人肝癌 MHCC97-H 細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)和分選，獲得 CD133+/CD133-MHCC97-H 細(xì)胞。
Notch 信號途徑：是一種細(xì)胞間相互作用的基本途徑，調(diào)控著細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程。在 Notch 途徑被激活時，干細(xì)胞發(fā)生增殖，活性受到抑制時，干細(xì)胞開始發(fā)生分化。
摘要
背景：以 CD133 為標(biāo)志物，利用其蛋白特異性特征可對不同的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分選和研究。
目的：探討干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD133 在肝癌中的表達(dá)及其陽性亞群的體外增殖特性。
方法：對人肝癌 MHCC97-H 細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)和分選，分別獲得 CD133+與 CD133-
MHCC97-H 細(xì)胞，檢測CD133 表達(dá)及細(xì)胞遷移侵襲能力；培養(yǎng) 14 d，檢測細(xì)胞克隆形成率；培養(yǎng) 7 d，檢測細(xì)胞增殖及 Notch 基因蛋白表達(dá)。將 CD133+與 CD133-MHCC97-H 細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，4 周后，檢測成瘤情況。
結(jié)果與結(jié)論：①CD133 表達(dá)與細(xì)胞克隆形成率：CD133+MHCC97-H 細(xì)胞 CD133 表達(dá)率、克隆形成率均顯著大于 CD133-MHCC97-H 細(xì)胞(P < 0.05)；②細(xì)胞增殖：CD133+MHCC97-H 細(xì)胞培養(yǎng) 3-7 d 的吸光度值大于 CD133-MHCC97-H 細(xì)胞(P < 0.05)；③細(xì)胞遷移侵襲：CD133+MHCC97-H 細(xì)胞遷移與侵襲實驗的透膜細(xì)胞數(shù)均顯著多于 CD133-MHCC97-H 細(xì)胞(P < 0.05)；④Notch 基因蛋白：CD133+MHCC97-H 細(xì)胞 Notch 基因蛋白表達(dá)多于 CD133-MHCC97-H 細(xì)胞(P < 0.05)；⑤成瘤實驗：CD133-MHCC97-H 細(xì)胞組成瘤體積大于CD133-MHCC97-H 細(xì)胞組(P < 0.05)；⑥結(jié)果表明：CD133 陽性肝癌細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的體外增殖特性，具有一定的腫瘤干細(xì)胞特性，并有較強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移及致瘤能力。
關(guān)鍵詞：
干細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞；肝癌；干細(xì)胞表面標(biāo)志；細(xì)胞亞群；細(xì)胞增殖；侵襲；轉(zhuǎn)移；干細(xì)胞特性；移植瘤；國家自然科學(xué)基金
主題詞：干細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；組織工程
基金資助：國家青年科學(xué)基金項目(81770221)：膜聯(lián)蛋白 A2 亞硝基化誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制

0 引言 Introduction
腫瘤細(xì)胞中存在一定的腫瘤干細(xì)胞，這是一類特殊的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新及分化能力。臨床治療中，腫瘤干細(xì)胞的敏感性不強(qiáng)，容易導(dǎo)致復(fù)發(fā)等情況的出現(xiàn)，影響預(yù)后效果[1]。為此，對腫瘤干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行分析，尋找有效的治療靶點至關(guān)重要。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，肝癌細(xì)胞中也存在一定的腫瘤干細(xì)胞[2]。在對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行研究時，人類白細(xì)胞分化抗原133(CD133)是一種重要的表面標(biāo)志物[3]。CD133具有*的信號傳遞通路，可參與到淋巴細(xì)胞再循環(huán)過程中，與腫瘤細(xì)胞之間存在十分密切的聯(lián)系[4]。以CD133為標(biāo)志物，利用其蛋白特異性特征可對不同腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分選和研究。此次實驗中，即以CD133為標(biāo)志物對人肝癌MHCC97-H細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)和分選，獲得CD133+/CD133-MHCC97-H細(xì)胞，并觀察其遷移侵襲、成瘤能力以及Notch基因蛋白的表達(dá)情況
等，以探討干細(xì)胞表面標(biāo)志CD133在肝癌中的表達(dá)及其陽性亞群的體外特性。
1 材料和方法 Materials and methods 
1.1 設(shè)計 體外細(xì)胞觀察性實驗及隨機(jī)對照動物實驗。
1.2 時間及地點 實驗于2015年8至12月在北京大學(xué)濱海醫(yī)院實驗室完成。
1.3 材料 人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H由上海信裕生物技術(shù)有限公司提供；11周齡雄性BALB/c裸鼠10只，體質(zhì)量20-25 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SYXK(京)2013-0058。
主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基、兔抗人Notch單克隆抗體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)；CD133抗體(澳大利亞，Hyclone公司)；胰蛋白酶(上海素爾生物科技有限公司)；FCR封阻試劑(北京方程生物科技有限公司)；CD133免疫微珠(北京德諾生物科技有限公司)；Giemsa染色液(北京普博斯生物科技有限公司)；MTT(上海滬鼎生物科技有限公司)；細(xì)胞裂解液(上海普飛生物技術(shù)有限公司)；PVDF膜上(上海睿安生物科技有限公司)；Transwell 小室(上海博耀生物科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(上海市恒斐生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀(上海雷浩信息科技有限公司)；酶標(biāo)儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。
1.4 實驗方法
1.4.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 利用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對人肝癌MHCC97-H細(xì)胞株進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞大部分長滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌后添加胰蛋白酶進(jìn)行消化。收集脫落細(xì)胞，添加*培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。收集對數(shù)期細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗。
1.4.2 肝癌細(xì)胞中的CD133表達(dá)率 對MHCC97-H細(xì)胞進(jìn)行重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109 L-1
后，添加CD133抗體進(jìn)行孵育。30 min后離心，再次重懸，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，記錄細(xì)胞CD133表達(dá)率。
1.4.3 CD133+/CD133-MHCC97-H細(xì)胞分選[5-6] 添加胰蛋白酶對MHCC97-H細(xì)胞進(jìn)行消化，進(jìn)行細(xì)胞重懸，離心后去掉上清，再次進(jìn)行細(xì)胞重懸。添加FCR封阻試劑和CD133免疫微珠，孵育后進(jìn)行離心和細(xì)胞重懸，過柱后分別收集CD133+、CD133-細(xì)胞。進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和傳代培養(yǎng)，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，對分選后細(xì)胞的CD133表達(dá)率進(jìn)行檢測和記錄。

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