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實(shí)驗(yàn)原理

若將可溶性的鼻疽抗原吸附在比其體積大千萬(wàn)倍的紅細(xì)胞表面上，使紅細(xì)胞產(chǎn)生一種新的血清學(xué)性質(zhì)，制成所謂的致敏紅細(xì)胞，即可用以診斷鼻疽。只要與少量相應(yīng)抗體相遇，紅細(xì)胞通過(guò)抗原抗體反應(yīng)，即可被動(dòng)地結(jié)合在一起，呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，陰性者紅細(xì)胞由于自然沉積于孔底，則呈圓點(diǎn)狀。這樣可以明顯地提高反應(yīng)的敏感性。

間接血凝試驗(yàn)即間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，它也存在一些缺點(diǎn)，例如不同批次制備的抗原或紅細(xì)胞，在敏感性和穩(wěn)定性方面，可能不一致，它很容易受外界因素的影響，發(fā)生非特異性凝集，所以應(yīng)用的器皿等就應(yīng)當(dāng)清潔，不要有污物或雜質(zhì)等，遇到非特異凝集時(shí)，要做間接凝集抑制試驗(yàn)(indirect hemagglutination inhibition test)，以排除非特異性反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的配制：

   甲液：Na₂HPO₄ 21.3 g (或Na₂HPO₄?12H₂O 53.72 g) NaCl 8.5 g

   乙液：KH₂PO₄ 20.42 g NaCl 8.5 g

上述甲、乙液配方各加蒸餾水至1000ml，溶解后，過(guò)濾，分別保存。使用時(shí)，將甲、乙液混合，再加等量的蒸餾水即配成0.15mol/L不同pH值的PBS，搖勻滅菌備用。

   pH值甲液：0.15mol/L Na₂HPO₄、NaCl

   乙液：0.15mol/L KH₂PO₄ NaCl

2. 1%兔血清緩沖鹽水的配制：將新分離的兔血清56℃ 30min滅活后，取所需量(如10ml)加約半量(如0.5ml)的洗過(guò)的壓積綿羊紅細(xì)胞，并加兔血清量4倍(如4ml)的pH值7.2 PBS，置37℃水浴箱中作用10min，以吸收兔血清中的異嗜性凝集素，1500 r/min離心10min，吸取上清，加pH值7.2 PBS 9.5ml，即為1%兔血清PBS液，置4℃冰箱中，可保存2天。

3. 阿氏液(Alsever’s solution)的配制：按以下配方配制，調(diào)正pH值6.1，過(guò)濾后分裝小瓶，以113℃高壓蒸氣滅菌15min后，置4℃冰箱中備用。

   枸櫞酸鈉(Na₃C₆H₅O₇?5H₂O)0.8 g

   葡萄糖2.05 g

   枸櫞酸0.0325 g

   氯化鈉0.42 g

蒸餾水加至100 ml

4. 紅細(xì)胞：無(wú)菌采取綿羊血液于阿氏液中，于4℃冰箱中保存，可供3周內(nèi)使用。

5. 固定劑：25%戊二醛溶液。

6. 鞣酸溶液：所用鞣酸必須是純品，用前用雙餾水配成1/200溶液(使用時(shí)，再用pH值7.2 PBS配成所需濃度)，放4℃冰箱中保存，可供一周內(nèi)使用。

7. 鼻疽抗原及被檢馬血清(56℃ 30min滅活)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 血清反應(yīng)板：為有機(jī)玻璃(聚甲基丙烯酸甲酯)制成，目前常用的為96孔板，長(zhǎng)132cm，寬84cm，厚12cm。板孔的形狀基本有兩種，即尖底的(V形)和圓底的(U形)，其中V形板可供血凝試驗(yàn)用，它較U形板具有更典型的凝集終點(diǎn)；U形板用于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)較好。96孔V形板的孔徑為0.6cm，每孔的總?cè)萘繛?.25ml。

用過(guò)的血清板，可以0.1%新潔爾滅、3%～5%次亞氯酸鈉或5%甲醛溶液浸泡1～2h，或用紫外線消毒，但不能用來(lái)蘇兒，因它可使血清板變色，如為無(wú)傳染性的被檢材料，可直接用清水沖洗3～4次后，晾干備用。由于血清板的硬度不夠，容易擦毛，所以洗擦?xí)r，可用紗布輕抹，不能用手指或硬布擦表面，以免發(fā)毛。清洗時(shí)，水溫不能超過(guò)90℃，以免變形。

2. 微量滴管：國(guó)內(nèi)尚無(wú)定型產(chǎn)品，可自行加工。所用玻璃滴管長(zhǎng)約20cm，于1/4處有一球形膨大部，下端接針頭處為磨口的，把16G號(hào)針頭磨平(即將針尖適當(dāng)磨鈍，以調(diào)正液滴大小，使每毫升恰為40滴)，使每滴量為0.025ml，上端接小乳頭。加液時(shí)，要使滴管與血清板成垂直位置，以盡量使每滴液體的量相同。

3. 稀釋棒：金屬制品。全長(zhǎng)約20cm，頭部為合金鋼制成，呈灰白色(氧化的金屬)，表面微粗糙些，以達(dá)到有效地吸取液體和吸取液體的一致性，為了長(zhǎng)期保持棒頭的氧化層，吸取的即便不是帶菌的液體，每使用20次，棒頭也應(yīng)過(guò)火一次，可燒至暗紅色，但不能燒至鮮紅。棒頭能蘸吸、移液和混合液體，能吸取液體是由于毛細(xì)管的作用和表面的粘附作用。目前國(guó)內(nèi)制造的棒頭上有8條縱溝，吸液量為0.025ml。

4. 微量血液振蕩器：為特制其振搖血清板的，可使孔內(nèi)的各要素混合的更均勻。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 紅細(xì)胞的致敏方法

   1) 紅細(xì)胞醛化：用新鮮紅細(xì)胞作間接血凝，不但紅細(xì)胞凝集的模型新鮮、典型，而且敏感性也好，但致敏紅細(xì)胞保存的時(shí)間短，而且由于不同批次或不同動(dòng)物個(gè)體的細(xì)胞具有一定的差異，可造成試驗(yàn)結(jié)果不一致，影響對(duì)結(jié)果的分析。為了克服這一缺點(diǎn)，目前多采用醛化法(如甲醛、戊二醛或丙酮醛)固定紅細(xì)胞，制備致敏紅細(xì)胞。經(jīng)醛化的紅細(xì)胞在普通冰箱中?保存1年以上，而且無(wú)明顯的溶血現(xiàn)象，致敏后的紅細(xì)胞敏感性，一般來(lái)說(shuō)，與新鮮紅細(xì)胞沒(méi)有明顯的差別。

取阿氏液保存的血液，用pH值7.2 PBS洗3次，每次均為3000r/min 3min，zui后一次去上清，取沉積的紅細(xì)胞2.5ml，加1%戊二醛(取25%冷戊二醛10ml和pH值7.2 PBS 240ml混合制成) 250ml，于4℃冰箱中醛化50min，中間振搖4~5次，取出后仍呈深紅色，極粘稠地沉積于離心管底，須強(qiáng)力方能攪拌起來(lái)，再以pH值7.2 PBS連續(xù)洗3次，每次均為3000r/min 3min，zui后一次去上清，加入含0.01%硫柳汞的pH值7.2 PBS 22.5ml，即為10%戊二醛化紅細(xì)胞液，置4℃冰箱中保存zui少可用1年。

   2) 醛化紅細(xì)胞鞣酸化：以10%醛化紅細(xì)胞12ml，加pH值7.2 PBS 8ml，以3000 r/min離心3min，如此洗2次，去上清，再加pH值7.2 PBS 4ml，即為3%紅細(xì)胞懸液，加4ml 1∶20 000鞣酸(1/200鞣酸用pH值7.2 PBS稀釋)，于37℃水浴中加溫15min，其間不斷振搖，使之充分作用，加溫完畢，以pH值7.2 PBS洗2次，每次均3000 r/min 3min，傾去上清，加4ml pH值7.2 PBS，即為3%鞣酸化紅細(xì)胞液。

   3) 鞣酸化紅細(xì)胞致敏：取鼻疽補(bǔ)反用抗原，以pH值6.4 PBS將其1∶100稀釋?zhuān)?ml稀釋的抗原加往鞣酸化紅細(xì)胞液4ml中，于37℃水浴中作用30min，以3000 r/min離心3min，去上清后，再加8ml 1%兔血清緩沖鹽水，即為間接血凝用15%致敏紅細(xì)胞診斷液(須加0.01%硫柳汞防腐)，置普通冰箱中可保存0.5～1年。對(duì)照用紅細(xì)胞診斷液，按上述方法以pH值6.4 PBS處理鞣酸化紅細(xì)胞即可。

操作方法

2. 實(shí)施反應(yīng)的操作方法：用微量滴管吸取1%正常兔血清pH值7.2 PBS分別滴加于血清板相鄰兩列孔中，每孔一滴即0.025ml，再取2支預(yù)濕的棒頭(先通過(guò)火焰燒紅、冷卻，放蒸餾水或生理鹽水的液面上預(yù)濕1min，注意不能將整個(gè)棒頭都浸到液體中，否則會(huì)有殘留液體，造成不正確的結(jié)果，再用吸水紙吸潮、校準(zhǔn))分別蘸取1∶100稀釋的被檢血清(56℃ 30min加熱滅活)0.025ml，各插入上下二列的第1孔稀釋液中，進(jìn)行捻轉(zhuǎn)對(duì)倍稀釋?zhuān)磙D(zhuǎn)稀釋棒的速度要適當(dāng)，太慢混合不均，太快易造成泡沫，使得稀釋不準(zhǔn)，通常每秒鐘捻轉(zhuǎn)2～3次為適宜，稀釋后血清第1～7孔的稀釋度分別為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，第8孔不加血清，為1%兔血清PBS對(duì)照。再用微量滴管吸取鼻疽抗原致敏的紅細(xì)胞診斷液往*列的每一孔中滴加0.025ml，再換另一支微量滴管吸取對(duì)照用鞣酸化細(xì)胞液滴加于第二列的每一孔中，每孔也為0.025ml。然后將血凝反應(yīng)板置于微型血液振蕩器上，振搖3～5min，充分混勻，取下反應(yīng)板，將其放于事先鋪有濕紗布的搪瓷盤(pán)內(nèi)，置37℃恒溫箱中1～15h(夏季放室溫下也可以)，取出觀察結(jié)果，必要時(shí)放室溫下過(guò)，再一次觀察反應(yīng)結(jié)果，并作終判。

3. 結(jié)果判定

判定時(shí)，應(yīng)首先看對(duì)照孔，只有在各個(gè)對(duì)照孔*正確的情況下，說(shuō)明反應(yīng)條件正常，方可對(duì)被檢血清列的結(jié)果作判定。

注意事項(xiàng)

1. 紅細(xì)胞也可用新鮮的，但凝集模型不穩(wěn)定，且不能長(zhǎng)期保存，如現(xiàn)用現(xiàn)采，不能保證各次試驗(yàn)結(jié)果的一致性。

2. 所用紅細(xì)胞的種類(lèi)除綿羊細(xì)胞以外，還可應(yīng)用人的O型紅細(xì)胞，及雞、馬的紅細(xì)胞等。

3. 被檢標(biāo)本的稀釋?xiě)?yīng)力求準(zhǔn)確，特別是使用稀釋棒進(jìn)行稀釋時(shí)，稀釋棒的旋轉(zhuǎn)次數(shù)或時(shí)間應(yīng)相對(duì)固定，一般每個(gè)稀釋度可旋轉(zhuǎn)稀釋50～100次，稀釋棒應(yīng)盡量不碰及血清板邊緣。

4. 血凝試驗(yàn)中，所用致敏紅細(xì)胞濃度，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的敏感度影響很大，一般說(shuō)，紅細(xì)胞濃度偏高，則終點(diǎn)效價(jià)低，紅細(xì)胞濃度低，則終點(diǎn)效價(jià)高，故紅細(xì)胞濃度力求準(zhǔn)確穩(wěn)定。

5. 稀釋液中的正常兔血清須經(jīng)56℃ 30min滅能，并用與致敏同批號(hào)的綿羊紅細(xì)胞充分吸收，以去除非特異性凝集素。

6. 稀釋棒用畢，以水沖洗干凈，用濾紙將水吸干，于火焰上將棒頭燒紅，冷卻后再用