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原生質體是指植物細胞去掉細胞壁的裸露部分。它在培養條件下,①具有再生細胞壁,進行連續的細胞分裂并再生成完整植株的能力;②具有攝取外源大分子、細胞器,以及細菌,病毒的能力,因此是進行遺傳操作,基因轉移的好材料;③通過同種和異種植物的原生質體融合,可產生異核體,實現體細胞雜交,培育出新品種。
實驗原理
去掉植物細胞壁的方法可以是機械的人工操作,也可以利用酶解法。較早利用機械法制備原生質體的*Klercker(1892),直到1960 年英國科學家Cocking 才*次用酶法大量制備原生質體。本實驗以植物的葉肉組織為材料,利用纖維素酶和果膠酶來消化細胞壁,分離細胞。
實驗用品
器具:顯微鏡、離心機、離心管、剪刀(2)、鑷子(2)、吸管、小培養皿、載片、蓋片。
試劑:0.16mol/L CaCI.2.H2O、20%蔗糖液、酶解液
材料:油菜或菠菜或煙草
實驗方法步驟
1、取材 根據實驗目的和條件選取不同的材料
2、分離原生質體
① 撕葉下表皮
② 酶解 將撕去下表皮的葉片剪成小塊,放在盛有5mL 酶液的小培養皿中,讓去除下表皮的一面接觸酶液,輔滿一層,在25~28℃下酶解60~90 分鐘
3、收集純化
(1)用吸管將酶解液吸至5mL 離心管中,以600rpm 離心5 分鐘以上,使原生質體沉降
(2)將上清(酶解液)回收,剩下原生質體及殘渣于管底
(3)加氯化鈣液約2mL,輕輕吹打均勻
(4)用注射器向離心管底部緩緩注入蔗糖約2—3mL,出現下部蔗糖液,上部原生質體懸浮液
(5)以600rpm 離心10 分鐘,在兩液相之間出現一條綠色帶,便是純凈的原生質體
4、觀察或培養
取少許原生質體于載片上,蓋片觀察其形態,或者將原生質體接種在培養基上進行培養,再生植株